Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
本明細書に提示される方法は、 アフリカツメガエルの嗅球に記録温度処理を目指すオタマジャクシをアフリカツメガエル 。第一プロトコル汚れや嗅球における二次ニューロンとは、嗅覚系は、主に無傷のままであるサンプル調製物を提供します。従って、温度感受性γ-糸球体の活性化をモニターし、その化学感受性隣接糸球体と比較することができます。この糸球体のユニークな二国間の神経支配は、スペクトルの異なる色素で細胞エレクトロポレーションにより可視化されます。また、ボーラスローディングは嗅球内の大ボリュームにまたがる僧帽細胞の染色を可能にします。神経回路網の処理温度によって誘起される信号は、反復刺激アプリケーションでカルシウム測定を行うと、その後の活性相関イメージングを使用してデータを分析することによって明らかにされます。
プロトコルは、2つの洗練された染色proceを強調します満足と再現性のある結果を達成するために慎重な操作と実践を必要とどちらもデュレス、。エレクトロポレーションの間に、動物の任意の損傷は、鼻孔に電極を配置する場合は特に、避けなければなりません。最適には、嗅上皮との接触は発生しません。動物は依然としてエレクトロポレーション手順の後に住んでいると、その回復時間が考慮されなければならないことに注意してください。染色は、使用される染料の種類に応じて発生することができるエレクトロポレーションの一巡後弱すぎるままである場合、その強度は、鼻孔内の色素濃度を増加させることによって高めることができます。デキストラン結合分子は(1-2 MM / 10日目の速度で)遅い軸索輸送と受動拡散を含むいくつかのメカニズムを介して輸送されているので、別の代替は、動物を犠牲にする前に、エレクトロポレーション後48時間を待つことです。あるいは、エレクトロポレーションは、回復の1日後に繰り返してもよいです。
jove_content ">ボーラスローディング色素の量は、僧帽細胞に入るので、重要なステップは、制御が困難であり、ピペットチップのサイズとアプリケーションの位置など様々なパラメータに依存する。共焦点蛍光顕微鏡下で手順の監視をするために有用であることがわかります染料適用の持続時間を調整するので、製剤にわたって同様の染色結果を生成する。また、以前にエレクトロオタマジャクシは、(γ-糸球体を含む)小クラスターの位置を特定することにより、色素のアプリケーションに最適な位置を決定するために使用されるべきである。最も測定中の重要なステップは、サンプルのシフト及び退色の両方を回避することである。シフト注意深く顕微鏡下リンガーフローを配置することによって回避することができる。関心領域の漂白を制限するように、測定時間が重要に低減されるべきです。カルシウム感受性色素を持つボーラスローディング染色は非常に提供します健康な細胞は一般的に低カルシウムレベルを有し、したがって、弱い基底蛍光を示すので、限られたコントラスト。活動の相関イメージングを適用すると、同様のカルシウムシグナルとの活動やハイライトの構造に基づいて、コントラストを生成することにより、この制限を回避します。このポスト取込み分析法は、3Dボリューム内で選択された関心領域(基準トレース)、各個々のピクセルのカルシウム信号との間の相関係数を算出します。したがって、強く得られた結果は、基準トレースとして選択された活動パターンに依存しています。主な焦点は、僧帽細胞の神経支配のパターンを可視化する場合、自発的神経活動に由来する基準信号が好ましく、最も活発な僧帽細胞を選択することが最良の結果を生成します。僧帽細胞の化学療法または感熱ネットワークを明らかにするために、唯一のヒスチジンまたは冷たいリンゲルのいずれかへの応答を含む参照トレースを選択する必要があります。全体糸球体oの選択rを関心領域として僧帽細胞体は、常に2つの異なる刺激に応答する構造が互いの上に横たわっている場合は特に、明確な基準トレースを提供することはできません。このような場合には、関心領域として糸球体または細胞体のより小さな領域を選択することがしばしば有用です。
過去数十年間では、エレクトロポレーションは、単一または複数のセル11,12を染色するための効率的な方法として記載されています。ここでは、特に嗅覚受容体ニューロンを標識するために使用されます。デキストランコンジュゲート分子は、最高の効率を与え、非カルシウム感受性色素のために、選択の範囲が広く、一般的に蛍光顕微鏡13で使用される完全なスペクトルをカバーしています。まだ市販されている場合は、成功した嗅覚受容ニューロンにエレクトロポレーションされているカルシウム感受性色素は、カルシウムグリーンデキストランに限定された瞬間にある、とのFluo-4デキストラン。また、録音は主にsuperficiaをターゲット唯一の嗅球の腹面にL層、高速測定技術の侵入深さが限られているからです。二光子イメージングは、部分的にこの制限を克服するが、多くの場合、速度を欠き、さらに選択可能なカルシウム感受性色素の量を制限することができます。
ここで嗅球における温度誘導活性を測定するためのプロトコルを記載しています。脳の神経網は、温度の嗅覚処理に関与する複雑な細胞ネットワークを可視化するために、3次元ボリュームとしてスキャンされます。嗅球で温度誘導活性を測定することは非常に最近5を報告し、異なる技術を組み合わせ、特にカスタマイズされた手順を必要とされています。上記の技術の主要な資産は、細胞の数百人が嗅覚系のほとんどが無傷のまま準備に3次元で画像化されていることです。これらの利点は、高い染色技術への要求だけでなく、脳pを置きます償いとイメージング。例えば、セルのエレクトロポレーションおよびボーラスロードは、嗅上皮および球で細胞を大量にヒットし、したがって完全な携帯電話ネットワークの可視化を可能にします。また、代わりに遺伝的にコード化された蛍光体のボーラスロードを介した化学指標の配信は、種の潜在的に大規模なセットでの測定を可能にします。 AM色素とバスのインキュベーションのような他の選択肢は、主に無傷組織のわずか数百マイクロメートルを残し、深刻な嗅球を損傷スライスで働いています。 γ-糸球体の二国間の神経支配は無傷のままと録音は、このように、まだ手術システムに取り込まれることを比較して、我々のプロトコルで使用されるホールマウントの準備は、例えば、保証されます。最後に、撮影自体は、3Dボリュームの取得を可能とするライン照明顕微鏡によって行われます。ライン照明顕微鏡は、可能な限り最高の取得率6を提供する共焦点技術の一つです</ SUP>嗅球の大部分をカバーするために必要です。遅い取得システムが使用されるが、記録されたボリュームのサイズを小さくしなければならないという欠点を有していてもよいです。近年、高速な画像取得のための他の方法が開発されており、代替14,15として使用することができます。それにもかかわらず、ライン照明顕微鏡は、十分な速度と分解能の両方を獲得するための最も簡単な方法の一つです。ここでは、適切な画像のセットアップを選択するためのガイドラインとして、いくつかの情報を、次の。カルシウムイメージングが厚い脳の調製物からの内で行われているので、セットアップはまともな共焦点を提供すべきであると目的は、1.0以上の開口数を持つ必要があります。基準点のために、ライン照明顕微鏡で撮影した記録は0.5-1軽やかユニットのピンホールサイズの標準的なレーザ走査型顕微鏡で撮影した画像に相当します。高速取得速度が望ましいです。厚さ20μmの体積は、少なくとも5リットルで覆われてエアーズ、100ミクロン×100ミクロンの側方視野と0.5μm以下のピクセルサイズは、スタックあたり1ヘルツの最低速度でスキャンする必要があります。共焦点性を低減することが数えた光子の量を増加させ、必要に応じてこのように高速取得を可能にするが、より焦点外の光を記録するという欠点を有することができます。このようなアプローチは、光学切片の厚さを増加させるので、それは実際にACI 6の適用後に別のz平面を介して樹状突起の追跡を容易にすることができます。
広く嗅球ネットワークに温度処理を研究するために必要なツールは、本明細書で提示されています。温度誘発性の活性は、カルシウム感受性色素との信号到着およびγ-糸球体から逸脱することの両方を介して第1および第2次ニューロンに記録されています。さらに、個々の僧帽細胞は、化学的および温度情報の両方を評価することができるプロセスれる程度。準備LEAので、無傷の嗅球VES、嗅覚処理における二国間の神経支配の役割をさらに研究することができます。手順は、嗅覚ネットワーク5を重ねて符号化されているかどうか、およびどのように熱電とchemoinformation明らかにするのに便利です。最後に、上記の技術は、嗅球における温度応答の研究に限定されないが、大きな三次元ボリュームにおける嗅覚系、特に細胞処理ネットワークのより一般的な評価のために適用することができます。ボーラスロードと活動の相関イメージングは、異なる脳のネットワーク16にそれらを適用すること、ニューロンの数十の活動を観察し、比較するための強力なツールです。
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |