Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con la colonna montante derivatizzazione (PCD) è un potente strumento che è utile a risolvere una serie di questioni nel laboratorio di analisi. Può essere usato per rilevare composti che sono altrimenti non rilevabili con la serie di rivelatori disponibili ^1,2, aumentare il segnale dell'analita bersaglio, che permette limiti inferiori di rivelazione e quantificazione ^3-5 o selettivamente derivatize un analita bersaglio per evitare effetti di matrice ^6. Reazioni PCD comunemente usati includono la reazione di ammine, come aminoacidi, con orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ^9,10 o fluorescamina ^11,12, la derivatizzazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) con il 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicali (DPPH ^{•) 13,14} o 2,2'-Azino-bis (acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico (ABTS) ^15,16, e l'uso del reagente ioduro-azide per derivatize zolfo ccomposti ontaining ^17,18.

Vi sono, tuttavia, numerosi inconvenienti all'utilizzo di reazioni PCD con sistemi HPLC ^6. Principalmente fra questi è l'uso di bobine di reazione tra il punto di aggiunta del reagente di derivatizzazione (s) e il rilevatore, che consentono il tempo per la miscelazione e la reazione avvenga ^8. Questi reazione loop spesso hanno volumi di 500 ml o più, che è significativo rispetto al volume del resto del sistema HPLC ^19. L'uso di questi reazione alto volume passanti comporta un'accresciuta allargamento di picco rispetto a quello che sarebbe osservata senza la presenza del ciclo di reazione. Ciò si traduce in brevi picchi più ampi che hanno limiti superiori di quantificazione e rilevazione e negativamente effetti risoluzione cromatografica. Figure 1 e 2 evidenziare il deterioramento della forma del picco che risultano dalla somma dei vari postale colonna volumi ciclo di reazione. Questa analisiè stata eseguita con un cellulare composizione di fase di 94% metanolo e 6% di acqua Milli-Q. La portata della fase mobile era 1 ml / min, il volume di iniezione era di 20 microlitri e la lunghezza d'onda di analisi era 265 nm. Bobine di varia volumi morti da 20 ml a 1000 ml sono stati inseriti fra la colonna ed il rivelatore per simulare gli effetti di ciclo reazione volume morto nei metodi PCD. Questi cicli sono stati preparati da tubi di acciaio inossidabile di diametro interno 0,5 mm. L'esperimento è stato eseguito su un sistema HPLC costituito da un controllore (SCL-10AVP), una bassa pressione gradiente valvola (FCL-10ALVP), una pompa (LC-20AD), un iniettore (SIL-10ADVP), ed un rivelatore PDA ( SPD-M10ADVP). La fase mobile è stata pompata attraverso un sistema di degasaggio prima dell'introduzione nel sistema HPLC. La separazione è stata effettuata utilizzando un x 4.6 mm di diametro 5 micron colonna di 250 mm. Le condizioni sperimentali sono stati scelti per essere tipico delle reazioni PCD che sono stati recentemente pubblicati in letteratura.

Ilsemplice, più comune alberino configurazione reattore a colonna è definito un reattore tubolare non segmentato che è effettivamente un tubo lungo e sottile attraverso il quale il liquido può fluire e la reazione può avvenire. In questo picco sistema allargamento dipende non solo il volume morto aggiunto al sistema, ma anche il diametro interno del tubo, come evidenziato da Iijima et al. ^8. Inoltre, la geometria della bobina gioca un ruolo nella ampliamento marchio osservato. Stewart ²⁰ affermato che l'avvolgimento del reattore cambia i profili di flusso secondario, con conseguente migliore miscelazione, il che significa che il volume morto può essere minimizzato. E 'stato affermato che il picco allargamento non è significativo se si utilizza un tubolare aperto maglia della bobina ^21. Quando l'allargamento picco è troppo grande, altri tipi di reattore possono essere considerati ^20,22. Questi possono includere reattori a letto o reattori flusso segmentati. Questi reattori sono particolarmente utili per le reazioni lente che altrimenti require grande reazione loop. Come non segmentati reattori tubolari sono i tipi più comuni di reattori utilizzati in applicazioni PCD, il resto di questa voce con questo tipo di configurazione del reattore.

Il disegno della colonna flusso di reazione (RF) comprende un raccordo terminale multi-porta che permette fase mobile per uscire (o entrare) della colonna attraverso un singolo porto situato nella zona centrale radiale della colonna o tre porte situata al esterno regione di parete della colonna (vedi Figura 3). Questi due flussi sono separati usando un raccordo terminale contenente una fritta porosa centrale che è circondato da un anello impermeabile che è a sua volta circondato da un setto poroso esterna che si estende verso la parete della colonna. A causa del flusso anello trasversale impermeabile centrale non è possibile tra le due zone porose.

Durante reazione cromatografia flusso, il reagente di derivatizzazione (s) vengono pompati contro la direzione del flusso della fase mobile in uno o two delle porte esterne della colonna flusso di reazione. L'eluente colonna viene miscelato con il reagente di derivatizzazione (s) in fritta esterno e passa al rivelatore tramite una porta esterna libera. flusso di reazione può essere utilizzato sia per una derivatizzazione reattivo unico (1 porta per il reagente derivatizzazione, 1 porta per passare l'eluente della colonna al rivelatore e 1 porta bloccata) oppure un sistema di reagente doppio (2 porte per i reagenti di derivatizzazione e 1 porta ad passare l'eluente della colonna al rivelatore). Il flusso dal flusso centrale può essere utilizzato sia per rilevare eluente colonna underivatized, efficace rilevamento multiplexing ^23, o passato sprecato.

Un importante tecnica sintonizzazione che è disponibile quando si esegue RF-PCD cromatografia è il rapporto tra i flussi centrali e periferici. Il rapporto ottimale per ogni derivatizzazione dipende da una serie di fattori come se il flusso centrale sarà rilevato o passato a perdere. Pertanto una volta che il rapporto ottimale è stato determinato, Occorre garantire che il rapporto corretto flusso è ottenuta prima di essere eseguita ogni corsa.

Si è trovato che l'uso di una fritta di mescolare il flusso della colonna eluente ed il reagente derivatizzazione in RF-PCD risultati in miscelazione più efficiente rispetto alle tecniche di miscelazione tradizionali che impiegano tipicamente un raccordo a T di zero volume morto o volume morto partire W- pezzo per mescolare i due flussi. Ciò ha permesso l'uso di relativamente piccoli cicli di reazione, o addirittura l'eliminazione del ciclo di reazione del tutto. La riduzione dei risultati di reazione formato loop in picchi più rispetto ai metodi tradizionali di derivatizzazione post-colonna. Ciò significa che, nonostante il fatto che non tutti dell'eluente colonna viene derivatizzato, maggiore rapporto segnale rumore sono osservati e limiti quindi minori di rivelazione e quantificazione può essere raggiunto.

cromatografia flusso di reazione è stata sviluppata per superare le difficoltà con l'adattamento reazione PCDs alle moderne colonne HPLC e sistemi, in particolare la perdita di efficienza causata da banda ampliando causa di grande colonna montante volumi morti dovuti alla necessità di impiegare grandi volumi di reazione loop. I processi di miscelazione più efficienti in RF-PCD rispetto al PCD convenzionale significa che i volumi del ciclo di reazione più piccoli possono essere impiegati portando ad un aumento di efficienza di separazione osservata. Inoltre RF-PCD cromatografia mostra sia il segnale aumentata e diminuita rumore rispetto alle tecniche convenzionali PCD con conseguente limiti inferiori di rilevazione e quantificazione rispetto ai metodi convenzionali PCD. Un ulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare il flusso underivatized che eluisce dalla porta centrale della colonna RF nonché il flusso derivatizzato che eluisce dalla regione periferica della colonna. RF-PCD è una relativamente nuova, ma promettente tecnica che consente di visualizzare molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali PCD.