Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), gekoppelt mit Nachsäulenderivatisierung (PCD) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das bei der Lösung einer Reihe von Fragen im analytischen Labor nützlich ist. Es kann verwendet werden , um Verbindungen zu detektieren , die ansonsten nicht nachweisbar mit der Suite von ^1,2 verfügbaren Detektoren sind, um das Signal des Zielanalyten erhöhen, was niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs ^3-5 oder selektiv ermöglicht Derivatisierung eines Zielanalyten , um zu vermeiden , Matrixeffekte ^6. Üblicherweise verwendete PCD Reaktionen schließen die Reaktion von Aminen, wie Aminosäuren, mit ortho-phthaladehyde ^7-9, Ninhydrin ^9,10 oder Fluorescamin ^11,12, die Derivatisierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit dem 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) ^{• 13,14} oder 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) ^15,16, und die Verwendung des Jodids-Azid – Reagenz Schwefel c zu derivatisierenontaining Verbindungen ^17,18.

Es gibt jedoch zahlreiche Nachteile bei der Verwendung von PCD Reaktionen mit HPLC – Systemen ^6. Hauptsächlich unter diesen ist die Verwendung von Reaktionsspulen zwischen dem Punkt der Zugabe des Derivatisierungsreagenz (n) und dem Detektor, die Zeit für das Mischen und die Reaktion erlauben , ⁸ auftreten. Diese Reaktionsschleifen haben oft Volumina von 500 & mgr; l oder mehr, was signifikant ist im Vergleich zu dem Volumen der Rest des HPLC – Systems ^19. Die Verwendung dieser hohen Volumenreaktionsschleifen führt zu einer erhöhten Spitzenverbreiterung Vergleich zu dem, was ohne die Anwesenheit der Reaktionsschleife beobachtet werden würde. Dies führt zu kürzeren, breiteren Spitzen, die eine höhere Grenzen der Quantifizierung und Detektion haben und negativ bewirkt chromatographische Auflösung. 1 und 2 unterstreichen die Verschlechterung der Peakform , die aus der Zugabe von verschiedenen Nachsäulenderivatisierung Schleife Volumina zur Folge haben . Diese Analysewurde mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase von 94% Methanol und 6% Milli-Q-Wasser durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml / min, war das Injektionsvolumen 20 & mgr; l und die Analyse Wellenlänge betrug 265 nm. Spulen unterschiedlicher Totvolumina von 20 & mgr; l bis 1000 & mgr; l wurden zwischen der Säule und dem Detektor eingesetzt, um die Auswirkungen der Reaktionsschleife Totvolumen in PCD Verfahren zu simulieren. Diese Schleifen wurden aus Edelstahlrohr von 0,5 mm Innendurchmesser hergestellt. Das Experiment wurde an einem HPLC-System durchgeführt, bestehend aus einer Steuereinheit (SCL-10AVP), eine Niederdruck-Gradient Ventil (FCL-10ALVP), eine Pumpe (LC-20AD), einem Injektor (SIL-10ADVP) und einem PDA-Detektor ( SPD-M10ADVP). Die mobile Phase war durch einen Entgaser vor der Einführung in das HPLC-System gepumpt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 250 mm x 4,6 mm ID-Säule 5 um durchgeführt. Versuchsbedingungen wurden gewählt, um die typisch für PCD Reaktionen, die vor kurzem in der Literatur veröffentlicht wurden.

Daseinfachste, am häufigsten Nachsäulenreaktor Aufbau ist eine nicht-segmentierten Rohrreaktor bezeichnet, die die Flüssigkeit fließt, durch die effektiv eine lange, dünne Röhre ist und die Reaktion stattfinden kann. In diesem System Spitze ist Verbreiterung abhängig nicht nur das Totvolumen zu dem System hinzugefügt, sondern auch der Innendurchmesser des Rohres , wie durch Iijima hervorgehoben et al. ^8. Darüber hinaus spielt Spulengeometrie eine Rolle bei der Marke Verbreiterung beobachtet. Stewart ²⁰ festgestellt , dass die sekundären Strömungsprofile des Reaktors Aufwickeln ändert, in eine bessere Durchmischung ergibt, was bedeutet , dass das Totvolumen minimiert werden kann. Es wurde festgestellt , dass die Peakverbreiterung nicht signifikant ist , wenn eine offene röhrenförmige Spule ²¹ gestrickt werden. Wenn die Peakverbreiterung zu große, andere Arten von Reaktoren ist auch ^20,22 angesehen werden kann. Diese können Bettreaktoren oder segmentierte Strömungsreaktoren umfassen. Diese Reaktoren sind besonders nützlich für langsame Reaktionen, die sonst require große Reaktionsschleifen. Als nicht-segmentierten Rohrreaktoren sind die häufigsten Arten von Reaktoren in PCD-Anwendungen verwendet werden, der Rest dieses Artikels befasst sich mit diesem Reaktortyp-Setup.

Die Gestaltung der Reaktionsstrom (RF) Spalte enthält einen Multiport-Endanschlußstück, die mobile Phase (oder Eingabe) die Säule entweder durch einen einzelnen Port an dem radialen mittleren Bereich der Kolonne oder drei Öffnungen an der äußeren Lage angeordnet zu verlassen erlaubt Wandbereich der Säule (siehe Abbildung 3). Diese beiden Ströme werden getrennt Endfitting mit einer zentralen porösen Fritte enthält, die durch eine undurchlässige Ring umgeben ist, der wiederum durch eine äußere poröse Fritte umgeben ist, die an der Kolonnenwand heraus erstreckt. Aufgrund der zentralen Strömungs undurchlässige Ringquer ist zwischen den beiden porösen Bereichen nicht möglich.

Während der Reaktionsströmungs Chromatographie das Derivatisierungsreagenz (s) gegen die Strömungsrichtung der mobilen Phase gepumpt in einen oder two der äußeren Öffnungen des Reaktionsstromkolonne. Die Säule wird mit dem Eluens Derivatisierungsreagenz (s) in der äußeren Fritte vermischt und zu dem Detektor durch einen freien Außen Port geleitet. Die Reaktionsstrom kann entweder für ein einzelnes Reagenz Derivatisierung verwendet werden oder einem dualen Reagenzsystem (2 Anschlüsse für die Derivatisierungsreagenzien (1-Port für den Derivatisierungsreagenzes, 1 Anschluss des Säuleneluent an den Detektor und 1 Port blockiert passieren) und 1-Port passieren die Säuleneluent zum Detektor). Die Strömung aus dem zentralen Strom kann entweder verwendet werden , um die nicht derivatisierte Säuleneluent zu erfassen, effektiv Multiplexen Detektions ²³ oder Abfall geleitet.

Eine Hauptabstimmungstechnik, die verfügbar ist, wenn ausgeführt RF-PCD-Chromatographie ist das Verhältnis der zentralen und peripheren fließt. Das optimale Verhältnis für jede Derivatisierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie beispielsweise, ob die zentralen Strömungs wird Abfall nachgewiesen oder übergeben werden. Daher einmal das optimale Verhältnis bestimmt worden istSollte es, dass die richtige Strömungsverhältnis wird jedem Lauf durchgeführt wird, bevor erreicht werden gewährleistet.

Es wurde gefunden, dass die Verwendung einer Fritte in effizienter Vermischung im Vergleich zu herkömmlichen Mischtechniken, verwenden typischerweise einen Null Totvolumen T-Stück oder geringes Totvolumen der Säule Eluentenstrom und das Derivatisierungsreagenz in RF-PCD Ergebnisse zu mischen W- Stück die beiden Ströme zu mischen. Dies hat sich für die Verwendung von relativ kleinen Reaktionsschleifen, oder sogar die Eliminierung der Reaktionsschleife insgesamt erlaubt. Die Reduktion der Reaktionsschleife Größe führt zu schärferen Peaks im Vergleich zu herkömmlichen Nachsäulenderivatisierung Methoden. Das bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säule Eluent wird derivatisiert, größeres Signal-Rausch-Verhältnisse eingehalten werden und somit niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs erreicht werden.

Die Reaktionsfluss-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung von PKD-Reaktion zu überwinden entwickelts zu modernen HPLC-Säulen und Systeme, insbesondere der Effizienzverlust durch Band verursachte Verbreiterung aufgrund der großen Post-Säule Toten durch die Notwendigkeit verursacht Volumina großes Volumen Reaktion zu verwenden Schleifen. Die effizientere Mischprozesse in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD bedeuten, dass kleinere Reaktionsschleife Volumina verwendet werden in beobachteten Abscheideleistung zu einer Erhöhung führt. Weiterhin RF-PCD-Chromatographie zeigt sowohl Signal erhöht und verringert Lärm im Vergleich zu herkömmlichen Techniken PCD in unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD führt. Ein zusätzlicher Vorteil des RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden ist die Fähigkeit, den underivatisierten Strom zu überwachen, die von dem zentralen Port des RF-Säule sowie der derivatisierten Strom eluiert, die aus dem Umfangsbereich der Säule eluiert. RF-PCD ist ein relativ neues, aber vielversprechende Technik, die viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden PCD zeigt.