הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה

כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם פוסט טור derivatization (PCD) היא כלי רב עצמה כי הוא שימושי בפתרון מספר בעיות במעבדה האנליטית. זה יכול לשמש כדי לזהות תרכובות שאינן אחר לגילוי עם החבילה של גלאי זמין ^1,2, להגדיל את האות של אנליטי היעד, המאפשר גבולות נמוכים של גילוי quantitation ^3-5 או סלקטיבי derivatize אנליטי יעד על מנת למנוע תופעות מטריקס ^6. בשימוש נפוץ התגובות PCD כוללים התגובה של אמינים, כגון חומצות אמינו, עם-phthaladehyde אורתו ^7-9, ninhydrin ^9,10 או fluorescamine ^11,12, את derivatization של מינים חמצן תגובתי (ROS) עם 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH ^{•) 13,14} או 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic חומצה (ABTS) ^15,16, ושימוש מגיב-אזיד יודיד כדי derivatize ג גופריתתרכובות ontaining ^17,18.

יש, עם זאת, חסרונות רבים לשימוש תגובות PCD עם מערכות HPLC ^6. בעיקר בקרב אלה הוא השימוש סליל תגובה בין נקודת תוספת של מגיב derivatization (ים) ו הגלאי, המאפשר זמן לערבוב והתגובה להתרחש ^8. יש תגובה אלה לולאות לעתים קרובות כרכים של 500 μl או יותר, אשר גבוה משמעותית לעומת היקף שאר המערכת HPLC ^19. שימוש תגובה בנפח גבוה אלה לולאות תוצאות רחבות שיא גדל לעומת מה יהיה ציין ללא הנוכחות של לולאת התגובה. התוצאה היא קצרות, פסגות רחבות יותר כי יש גבולות גבוהים של quantitation וזיהוי ואפקטים שלילי רזולוצית chromatographic. איורי 1 ו -2 להדגיש את ההידרדרות של צורת שיא הנגרמות כתוצאה מהתוספת של כרכי לולאת תגובה שונים פוסט עמודה. ניתוח זהבוצע באמצעות רכב שלב נייד של מתנול 94% ו -6% מי מילי- Q. קצב הזרימה של השלב הנייד היה 1 מ"ל / דקה, את עוצמת הזריקה היה 20 μl ואת אורך הגל הניתוח היה 265 ננומטר. סלילי של כמויות משתנות מת מ -20 μl 1,000 μl הוכנסו בין הטור לבין הגלאי כדי לדמות את ההשפעה של נפח מת לולאת תגובה בשיטות PCD. לולאות אלה הוכנו מ צינורות נירוסטה של ​​קוטר פנימי 0.5 מ"מ. הניסוי בוצע על מערכת HPLC המורכבת של בקר (SCL-10AVP), בלחץ נמוך Gradient Valve (FCL-10ALVP), משאבה (LC-20AD), מזרק (SIL-10ADVP), וגלאי PDA ( SPD-M10ADVP). השלב הנייד נשאב באמצעות מסלק גזים לפני המבוא למערכת HPLC. ההפרדה בוצעה באמצעות טור 250 מ"מ x 4.6 מ"מ id 5 מיקרומטר. תנאי הניסוי נבחרו להיות אופייני של תגובות PCD אשר פורסמו לאחרונה בספרות.

הפשוט, התקנת כור טור פוסט הנפוץ ביותר נקראת כור צינורי הלא מפולח אשר הוא למעשה צינור ארוך, דק שדרכו הנוזל יכול לזרום ואת התגובה יכולה להתרחש. בשנת שיא במערכת זו רחבה תלויה לא רק את הנפח מת להוסיף למערכת, אלא גם את הקוטר הפנימי של הצינור כפי מודגש על ידי Iijima et al. ^8. יתר על כן, גיאומטרית סליל ממלא תפקיד הרחבת המותג ציינה. סטיוארט ²⁰ נאמר כי התפתלות של הכור משנה את פרופילי זרימה משני, וכתוצאה מכך ערבוב טוב יותר, כלומר הנפח המת יכול להיות ממוזער. זה כבר נאמר כי הרחבת השיא הוא לא משמעותי בעת שימוש צינורי פתוח סרוגים סליל ^21. כאשר הרחבת השיא היא גדולה מדי, סוגים אחרים של כורים יכולים גם להיחשב ^20,22. אלה עשויים לכלול כורי מיטה או כורי תזרים מפולחים. כורים אלה הם שימושיים במיוחד עבור תגובות איטיות שאחרת requirלולאות התגובה הגדולה הדואר. כמו כורי צינורי הלא מפולחים הם הסוגים הנפוצים ביותר של כורים המשמשים ליישומי PCD, שאר מאמר זה עוסק בסוג זה של התקנת כור.

העיצוב של זרימת תגובה (RF) טור משלבת הולמת סוף מרובה יציאות מאפשרת בשלב נייד כדי לצאת (או להיכנס) בעמודה או דרך יציאה אחת הממוקמת באזור המרכז הרדיאלי של העמודה או שלוש יציאות הממוקמים בחלק החיצוני קיר באזור של הטור (ראה איור 3). זרמים אלה שני מופרדים באמצעות הולם סוף המכיל frit נקבובי מרכזי מוקפת טבעת חדירה כי הוא בתורו המוקף frit הנקבובי חיצוני המשתרע החוצה אל קיר העמודה. בשל זרימת צלב טבעת המרכזית החדירה אינו אפשרי בין שני האזורים הנקבוביים.

במהלך כרומטוגרפיה זרימת תגובה, מגיב derivatization (ים) נשאבים נגד כיוון זרימה בשלב נייד לאחת או TWo הנמלים החיצוניים של טור זרימת תגובה. Eluent הטור הוא מעורבב עם מגיב derivatization (הים) frit החיצוני והעביר אל הגלאי דרך יציאה חיצונית בחינם. זרימת תגובה יכולה לשמש אחת מעמד derivatization מגיב יחיד (1 נמלית מגיב derivatization, 1 יציאה להעביר את eluent העמודה אל הגלאי ו -1 היציאה החסומה) או מערכת מגיב כפולה (2 יציאות עבור ריאגנטים derivatization ו -1 יציאה להעביר את eluent עמודה אל הגלאי). תזרים מן הזרם המרכזי או שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את eluent טור underivatized, ריבוב ביעילות זיהוי ^23, או עבר לבזבז.

טכניקת כוונון אחד עיקרית זמינה בעת הפעלת כרומטוגרפיה RF-PCD הוא היחס של התזרים המרכזי ואת הפריפריה. היחס האופטימלי עבור כל derivatization תלוי במספר גורמים כגון האם הזרם המרכזי יזוהו או עבר לבזבז. לכן פעם היחס האופטימלי נקבע, יש להבטיח את זה כי יחס התזרים הנכון מושגת לפני כל סיבוב מתבצע.

זה כבר נמצא כי השימוש של frit לערבב את זרם eluent עמודה מגיב derivatization בתוצאות RF-PCD ב ערבוב יעיל יותר לעומת טכניקות ערבוב המסורתי שבדרך כלל להעסיק נפח מת אפס מת נפח T-piece או נמוך פ- חתיכה לערבב שני הזרמים. זו אפשרה את השימוש של לולאות תגובה קטנות יחסית, או אפילו החיסול של לולאת התגובה כלילה. צמצום תוצאות גודל לולאת תגובת פסגות חדות בהשוואה לשיטות derivatization טור פוסט מסורתיות. משמעות דבר היא כי, על אף העובדה כי לא כל eluent העמודה derivatized, אות גדולה יחס רעש הם נצפו ולכן גבולות נמוכים של גילוי quantitation יכולים להיות מושגת.

כרומטוגרפיה זרימת תגובה פותחה כדי להתגבר על קשיים עם התאמת תגובת PCD ים לעמודות ומערכות HPLC מודרניים, במיוחד מההפסד היעיל הנגרם על ידי להקת הרחבה בשל כרכים מתו טור פוסט גדולים הנובעים מהצורך להעסיק תגובת נפח גדולה לולאות. תהליכי הערבוב היעילים יותר ב RF-PCD לעומת PCD הקונבנציונלי אומרים כרכי לולאת תגובה קטנה יכולים להיות מועסקים מובילים לעלייה יעילה הפרדה נצפית. יתר על כן כרומטוגרפיה RF-PCD מראה הן גדלו אות וירידת רעש לעומת טכניקות PCD קונבנציונליות וכתוצאה מכך גבולות נמוכים של גילוי quantitation בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונליים. יתרון נוסף של RF-PCD בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונאלי היא היכולת לנטר את זרם underivatized כי elutes מהנמל המרכזי של הטור RF כמו גם את זרם derivatized כי elutes מאזור הפריפריה של הטור. RF-PCD היא טכניקה חדשה יחסית אך מבטיח המציג יתרונות רבים על פני שיטות PCD המסורתית.