Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con la columna posterior derivatización (DCP) es una poderosa herramienta que es útil para resolver una serie de problemas en el laboratorio de análisis. Se puede utilizar para detectar compuestos que son de otro modo indetectable con la suite de detectores disponibles ^1,2, aumentar la señal del analito diana, lo que permite límites inferiores de detección y cuantificación ^3-5 o selectivamente derivatizar un analito diana a fin de evitar ⁶ efectos de la matriz. Reacciones de PCD comúnmente usados ​​incluyen la reacción de aminas, tales como aminoácidos, con orto-phthaladehyde ^7-9, ninhidrina ^9,10 o fluorescamina ^11,12, la derivatización de las especies reactivas de oxígeno (ROS) con el 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicales DPPH ^(•) o ^13,14 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) ^15,16, y el uso del reactivo de yoduro-azida para derivatizar azufre ccompuestos ontaining ^17,18.

Hay, sin embargo, numerosos inconvenientes a la utilización de reacciones de PCD con sistemas de HPLC ^6. Principalmente entre estos es el uso de bobinas de reacción entre el punto de adición del reactivo de derivatización (s) y el detector, que permiten tiempo para la mezcla y la reacción se produzca ^8. Estos bucles de reacción a menudo tienen volúmenes de 500 l o más, lo que es significativo en comparación con el volumen del resto del sistema de HPLC ^19. El uso de estos reacción alto volumen bucles de resultados en el aumento ensanchamiento de los picos en comparación con lo que se observaría sin la presencia del bucle de reacción. Esto se traduce en más cortos picos más amplios, que tienen límites más altos de cuantificación y detección y negativamente los efectos que la resolución cromatográfica. Las figuras 1 y 2 destacan el deterioro de la forma de los picos que resultan de la adición de varios volúmenes de bucle de reacción post columna. Este análisisse realizó con una composición de fase móvil de 94% de metanol y 6% de agua Milli-Q. La velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1 ml / min, el volumen de inyección fue de 20 l y la longitud de onda análisis fue 265 nm. Las bobinas de diferentes volúmenes muertos de 20 l a 1000 l se insertaron entre la columna y el detector para simular los efectos de bucle de reacción volumen muerto en los métodos de PCD. Estos bucles se prepararon a partir de tubo de acero inoxidable de diámetro interno 0,5 mm. El experimento se realizó en un sistema HPLC que consta de un controlador (SCL-10AVP), una baja presión del gradiente de la válvula (FCL-10ALVP), una bomba (LC-20AD), un inyector (SIL-10ADvp), y un detector de PDA ( SPD-M10ADVP). La fase móvil se bombea a través de un desgasificador antes de la introducción en el sistema de HPLC. La separación se realizó usando un identificador de 5 micras columna de 250 mm x 4,6 mm. Las condiciones experimentales fueron elegidos para ser típica de las reacciones de PCD que recientemente han sido publicados en la literatura.

losmás simple, la configuración más común de post reactor de columna se denomina un reactor tubular no segmentado que es efectivamente un tubo largo y delgado a través del cual el líquido puede fluir y la reacción puede tener lugar. En este pico del sistema ensanchamiento depende no sólo el volumen muerto añadido al sistema, sino también el diámetro interior del tubo como se destaca por Iijima et al. ^8. Por otra parte, la geometría de la bobina juega un papel importante en la ampliación de la marca observada. Stewart ²⁰ declaró que bobinado del reactor cambia los perfiles de flujo secundarias, lo que resulta en un mejor mezclado, lo que significa que el volumen muerto puede ser minimizado. Se ha dicho que ensanchamiento de los picos no es significativa cuando se utiliza un punto tubular abierta bobina ^21. Cuando el ensanchamiento de los picos es excesivamente grande, otros tipos de reactores también pueden ser considerados ^20,22. Estos pueden incluir reactores de lecho o reactores de flujo segmentados. Estos reactores son particularmente útiles para reacciones lentas que de otro modo requirbucles e gran reacción. Como reactores tubulares no segmentados son los tipos más comunes de los reactores utilizados en aplicaciones de PCD, el resto de este artículo trata con este tipo de configuración del reactor.

El diseño de la columna de flujo de reacción (RF) incorpora un accesorio en el extremo de varios puertos que permite a la fase móvil para salir (o entrar) la columna a través de un puerto único situado en la región central radial de la columna o tres puertos situados en el exterior región de la pared de la columna (véase la Figura 3). Estas dos corrientes se separan usando un accesorio en el extremo que contiene una frita porosa central que está rodeado por un anillo impermeable que está a su vez rodeado por una frita de vidrio poroso exterior que se extiende a la pared de la columna. Debido al flujo transversal anillo impermeable central no es posible entre las dos regiones porosas.

Durante cromatografía de flujo de reacción, el reactivo (s) de derivatización se bombea contra la dirección de flujo de la fase móvil en una o two de los puertos exteriores de la columna el flujo de reacción. El eluyente de la columna se mezcla con el reactivo (s) de derivatización en la frita exterior y se pasa al detector a través de un puerto exterior libre. flujo de reacción se puede utilizar ya sea para una derivatización solo reactivo (1 puerto para el reactivo de derivatización, 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector y 1 puerto bloqueado) o un sistema de reactivos dual (2 puertos para los reactivos de derivatización y 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector). El flujo de la corriente central o bien se puede utilizar para detectar el eluyente de la columna no derivatizado, con eficacia de detección de multiplexación ^23, o pasado a los residuos.

Una de las principales técnica de sintonización que está disponible cuando se ejecuta la cromatografía de RF-PCD es la relación de los flujos central y periférico. La relación óptima para cada derivatización depende de una serie de factores tales como si se detecta o se pasa a perder el flujo central. Por lo tanto una vez que la relación óptima se ha determinado, Se debe asegurar que la relación de flujo correcta se consigue antes de cada carrera se realiza.

Se ha encontrado que el uso de una frita para mezclar la corriente de la columna de eluyente y el reactivo de derivatización en los resultados de RF-PCD en una mezcla más eficiente en comparación con técnicas de mezcla tradicionales que emplean típicamente un volumen muerto cero pieza en T o de bajo volumen muerto W- pieza a mezclar las dos corrientes. Esto ha permitido el uso de bucles de reacción relativamente pequeñas, o incluso la eliminación de la del circuito de reacción en conjunto. La reducción de los resultados de la reacción de tamaño de bucle en picos más agudos en comparación con los métodos tradicionales de derivatización post-columna. Esto significa que, a pesar del hecho de que no todo el eluyente de la columna se derivatiza, una mayor relación señal-ruido se observan y por lo tanto los límites inferiores de detección y cuantificación se puede lograr.

cromatografía de flujo de reacción se ha desarrollado para superar las dificultades con la adaptación de la reacción PCDs a modernas columnas de HPLC y los sistemas, en particular la pérdida de eficacia provocada por banda ensanchamiento debido a las grandes columnas poste volúmenes muertos causados ​​por la necesidad de emplear bucles de reacción de gran volumen. Los procesos de mezcla más eficientes en RF-PCD en comparación con PCD convencionales significan que los volúmenes de bucle de reacción más pequeño se pueden emplear conduce a un aumento de la eficacia de separación observada. Además cromatografía RF-PCD muestra tanto el aumento de la señal y el ruido disminuyó en comparación con las técnicas convencionales de PCD que resulta en límites inferiores de detección y cuantificación en comparación con los métodos convencionales de PCD. Una ventaja adicional de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es la capacidad de controlar la corriente no derivatizado que eluye desde el puerto central de la columna de la RF, así como la corriente de derivatizado que eluye de la región periférica de la columna. RF-PCD es una forma relativamente nueva pero prometedora técnica que muestra muchas ventajas sobre los métodos tradicionales de PCD.