The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Vi konstruerte lineære kovalent lukket (LCC) DNA minivectors som en ikke-virale gen-avgivelsesvektor alternativ fremstilt via en enkel plattform in vivo. DNA ministrings ha en økt sikkerhetsprofil og også effektivt levere DNA last til målrettede celler. Konvensjonelle DNA-vektorer som bærer uønskede prokaryote sekvenser, inkludert antibiotikaresistensgener, CpG-motivene og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon, noe som kan føre til stimulering av verts immunologiske responser. Biotilgjengeligheten av konvensjonelle DNA-vektorer er også kompromittert på grunn av deres større molekylstørrelse. Deres sirkulær naturen kan også formidle kromosomal integrasjon, som fører til insertional mutagenese.
Bakterielle sekvenser er fjernet fra DNA minivectors, slik at bare det aktuelle genet (GOI) og nødvendige eukaryote uttrykk elementer. Våre LCC DNA minivectors, eller DNA ministrings, er blottet for immunogene bakterielle sekvenser; derfor bedre thEIR biotilgjengelighet og GOI uttrykk. I tilfelle vektor integrering inn i kromosomet, vil LCC DNA ministring letalt forstyrre vertskromosomet, for derved å fjerne den potensielt farlige mutanten fra den prolifererende cellepopulasjonen. Derfor DNA ministrings tilby fordelene med 'minicircle' DNA mens de eliminerer faren for uønskede vektor integrering hendelser. Sammenlignet med konvensjonelle plasmider og deres isogene sirkulære kovalent lukket (CCC) motstykker, DNA ministrings demonstrerer overlegen biotilgjengelighet, transfeksjonseffektivitet, og cytoplasmatiske kinetikk – de således krever lavere mengder av kationiske overflateaktive midler for effektiv transfeksjon av målceller.
Vi har konstruert en ett-trinns induserbar in vivo system for fremstilling av DNA-ministrings i Escherichia coli som er enkel å bruke, hurtig, og skalerbar.
Målet er å produsere skalerbare mengder lineær kovalent lukket (LCC) DNA minivectors ved hjelp av en enkel og høy effektivitet ett-trinns varme induserbar in vivo DNA ministring produksjonssystem. DNA ministrings tilveiebringe en trygg og effektiv ikke-viral strategi for å levere DNA. De kombinerer sikkerheten til LCC vektorer med effektiviteten av DNA-minicircles, og også gi et tryggere alternativ til virus-avledede vektorer uten at det går transfeksjonseffektivitet.
For at et transgen leveringssystem for å være vellykket, må DNA-vektor gå inn i mål-vertscellen og uttrykke det kodede transgenet (ene). Det er flere cellulære hindringer som må overvinnes i praksis, spesielt i pattedyrsystemer. For å unngå degradering av serum nukleaser og immundeteksjon av retikuloendoteliale system, må DNA-vektor være bio- og immun-kompatibel med target system. Ubeskyttet DNA er raskt fordøyd av plasma nukleaserog plasmidet membranen består av tett lipoprotein barrierer, slik at DNA-vektoren må være istand til hurtig å krysse plasmamembranen av målceller. En gang i cellen, må vektorene traversere cytoplasma og passerer gjennom kjernemembranen å gå inn i kjernen for transgene uttrykk. Ikke-virale genet levering teknikker fokus på forbedring av vevs- og celle målgruppe. Men bruk av konvensjonelle plasmider med disse teknikkene reduserer transfeksjonseffektivitet på grunn av tilstedeværelsen av immunogene bakterielle sekvenser, som hurtig demper genekspresjon 1,2. Konvensjonelle plasmider vanligvis bærer antibiotikaresistensgener for vedlikehold i prokaryote systemer. Imidlertid kan disse gi potensielle negative effekter i humane verter eller meddele motstand til naturlig forekommende verts flora via horisontal genoverføring effekter. Konvensjonelle plasmider inneholder også dinucleotide CpG motiver to, noe som kan utløse en uønsket immunrespons, potensieltredusere eller stanse transgene uttrykk.
Ettersom de er utelukkende består av den eukaryotiske ekspresjonskassetten, DNA minivectors, slik som DNA minicircles 3, er et bedre alternativ for genavlevering som de utviser forbedret ekstracellulær og intracellulær biotilgjengelighet og bedret genekspresjon på grunn av deres reduserte størrelse og fravær av immunstimulerende prokaryote elementer 4. De reduserte vektorstørrelse fares bedre med hensyn til motstand mot skjærkrefter i forbindelse med in vivo-administrering til et målområde 5. Jo høyere kopiantall av vektoren pr masseenhet krever mindre transfeksjon reagens, og dermed redusere toksisitet. Imidlertid, i tilfelle av tilfeldig vektor integrering i en vertskromosomet, sirkulært kovalent lukket (CCC) vektorer, inkludert både DNA minicircles og vanlige plasmider, bibringe molekylær kontinuitet og derfor kan føre til insertional mutagenese, som kan ha ødeleggende konsekvenser <sopp> 6. Relativt, integrasjon av en lineær DNA-vektor forstyrrer kromosomet og initierer celledødsveier, for derved å fjerne den mutante cellen fra prolifererende cellepopulasjon og å hindre insertional mutagenese 7. Minimalistisk immunologisk definert genekspresjon (Midge) vektorer 8 og mikro-lineære vektorer 9 (MiLV) er LCC DNA vektorer utviklet in vitro. Knott vektorer har vist opp til en 17 gangers forbedret transgen ekspresjon in vivo sammenlignet med konvensjonell plasmid-DNA-vektorer 11, og har vist lovende resultater i vaksine 10 og cancer 8 genterapi. I tillegg, på grunn av vridningsfrie struktur av LCC minivector, er mindre transfeksjon reagens som kreves i forhold til den CCC supercoil motstykke, og dermed redusere toksisiteten 7.
Våre forbedrede LCC DNA vektorer, ministrings DNA, har vist overlegen uttrykk effektivitet og bioavailabilitet 7. Videre er DNA-ministrings produsert på en ett-trinns varme induserbare in vivo produksjonssystem, en hensiktsmessig og kostnadseffektivt alternativ til mygg og MiLV LCC vektorer, som krever flere trinn in vitro. DNA ministring produksjonssystemet som skal påvises er en enkel varme induserbare prosess som utføres in vivo, noe som gjør det både kostnadseffektiv og lett skalerbar. Dette systemet utnytter Yersinia enterocolitica bakteriofag PY54-avledet Tel / pal protelomerase rekombinasjon system 12 for å skille minimal eukaryote uttrykk kassett fra prokaryote plasmid ryggrad. Vi har konstruert Escherichia coli-celler (W3NN) for å uttrykke Tel protelomerase under kontroll av den varme induserbar promoter bakteriofag λ, cl [Ts] 857 13. Ved uttrykk, fungerer Tel protelomerase på pal målse stede i "Super Sequence" (SS) områder som ligger på forløperen plasmidfor å gi LCC-produkter, hvorfra DNA ministring kan deretter renses (figur 1). SS steder på DNA ministring forløper plasmid også kode målwebområder for andre rekombinaser inkludert Cre rekombinase (lox), TELN protelomerase (telRL) og Flp rekombinase (FRT), og dermed legge til rette for produksjon av isogen LCC og CCC minivectors fra en forløper plasmid. I tillegg er hver SS område flankert på begge sider av SV40 enhancer (SV40e) sekvenser, som tjener til å forbedre kjernetrans 14. Vi har vist andre steder at suksessiv tilsetning av SV40e gradvis overfører tilsvarende økning i transfeksjonseffektivitet 7. Forløperen plasmid (pDNA MiniString eller PDMS) inneholder en polylinker (figur 1) for å lette innføring av en hvilken som helst ønsket gen av interesse i transkripsjonen fusjon med den grønne fluorescerende reporter (GFP).
DNA minivector teknologi kanbli brukt i stedet for konvensjonelle metoder for genoverføring, ekspresjon av rapportørgener, og vurderinger mot effektiviteten av transgene ekspresjon i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og økt transfeksjon effektivitet fordelene med "mini" vektorer med den overlegne sikkerhetsprofilen av lineære DNA-vektorer. Vår robust ett-trinns produksjonsplattform raskt og enkelt produserer DNA ministrings for ethvert genoverføring søknad og tilbyr en høyere sikkerhetsprofil.
Vi beskriver her et enkelt system for produksjon av LCC DNA ministrings ved hjelp av en ett-trinns varme induserbar protokollen, som ikke krever noen spesialutstyr bortsett fra det som brukes i typisk bakterievekst og manipulasjon. DNA ministrings er vridningsfritt, stabile lineære DNA uttrykk kassetter, blottet for prokaryote genetiske elementer. De kan anvendes i stedet for konvensjonelle metoder for genoverføring, ekspresjon av rapportørgener, så vel som i vurderinger mot effektiviteten av transgene ekspresjon i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og økt transfeksjon effektivitet fordelene med "mini" vektorer med den overlegne sikkerhetsprofilen av lineære DNA-vektorer. Våre robust ett-trinns in vivo produksjonsplattform hurtig og lett produserer DNA ministrings for enhver genoverføring anvendelse uten behov for flere kostbare in vitro-prosesser.
Det er flere viktige skritt for åsikre optimal ministring produksjon (figur 2 og 3). Heat induksjon er den mest kritiske trinnet til ministring produksjon. Fullstendig mangel på ministring produksjon er mest sannsynlig på grunn av mangel på varmeindusert (celler beholdt ved 30 ° C), hvor undertrykkelse av protelomerase ekspresjon hindrer omdannelse av forløperen til plasmid LCC ministring. Etter varmeinduksjonsprotokollen, kan forvente en produksjonseffektivitet på omtrent 75%. Varmeindusert er optimal når cellene er i logaritmisk fase. Selv om det ikke er noen statistisk signifikant forskjell i ministring PE ved bruk av celler i stasjonær fase ( "Tilgrodd", figur 3), vi observere nesten en 50% reduksjon i totale plasmid utbytte. Utbytter vil avhenge av plasmidet utvinning protokollen som brukes. For optimal ministring produksjon, utløse varme induksjon mens cellene er i log fase. Dårlig ministring produksjon vil mest sannsynlig være et resultat av langvarig temperaturoppgiring eller insufficient temperatur nedgiring. Langvarig temperatur oppgiring frarådes da dette aktiverer E. coli heat shock reaksjon 15, som kan hemme protelomerase aktivitet og forstyrrer plasmidstabilitet. Derfor timing temperaturen nedgiring er et annet viktig skritt for effektiv ministring produksjon. Uten ekstra inkubasjonstid på 30 ° C, ble ministring produksjonseffektivitet funnet å være svært dårlig ( "Early fjerning", figur 3). Dette kan tilskrives den tid som kreves for Tel ekspresjon og aktivitet. Den stammer profag PY54 koding Tel protelomerase normalt infiserer Yersinia, som optimalt vokser rundt 28 ° C 12, noe som indikerer at 30 ° C kan også være mer optimal for Tel aktivitet.
DNA minivector produksjonssystemet benytter en in vivo plattform for å generere høy kvalitet bakterie sekvens-fri DNA minivectors. Endringer i protokollen kan jegnclude å endre vekstmedier for å optimalisere plasmid og proteinfremstilling for å fremme cellevekst i løpet av vekstfasen (TB istedenfor LB), eller øke produksjonen ministring og omdannelseseffektiviteten. For større kulturvolumer (200 ml) og større, temperatur nedgiring og inkubering ved 30 ° C kan forlenges over natten uten alvorlig negativ innvirkning på ministring PE. Vi har tatt med modifikasjoner i vår protokoll for 500 ml kulturer som et eksempel. Rensing av DNA-ministrings kan bli fremskyndet ved in vitro-spalting av den prokaryote ryggraden. Det finnes et antall endonuklease målse (for eksempel PI-SCEI, Pvul, Seal) som er tilgjengelig på den prokaryote ryggrad forløperen plasmid, som kan kuttes for å eksponere åpne lineær ender, slik at for in vitro-nedbrytning av prokaryote ryggraden. Isolering av ministrings fra andre vektorarter kan også oppnås ved anionbytter-kromatografi membranen 16.
En strømbegrensning i forbindelse med LCC DNA-vektoren produksjonssystem er det behov for rensing av DNA fra flere ministring LCC og CCC-produkter. Selv om lett renses ved anvendelse av standard plasmid isoleringsmetoder, kan isolasjonstrinnet fremdeles være en ulempe i en stor-skala setting. Separasjon av ministring kan være tidkrevende å bruke AGE hvis ministring og LCC prokaryote ryggrad er for like i størrelse. Alternativt kan anionbyttermembran kromatografi gi bedre separasjon av ministrings fra CCC vektorarter 16. Temperatur oppgiring kan være en annen potensiell begrensning som høye temperaturer også aktivere varmesjokk respons i E. coli, noe som virker negativt rekombinant protein gir 17 og dermed redusere forekomsten av plasmid til ministring konvertering. Vi rapporterer et annet sted optimaliseringer av produksjonsplattformen for å omgå og / eller dempe slike effekter av varmesjokk 18. Vier også for tiden å optimalisere fremgangsmåter for å eliminere eller redusere LCC prokaryot backbone forurensning in vivo.
Kromosomal integrering av LCC DNA ministring forstyrrer vertskromosomet og utsetter celle apoptose. Ikke bare gjør dette redusere eventuelle negative konsekvenser av insertional mutagenese som onkogenese og lyddemping av tilstøtende gener, og dermed forbedre sin sikkerhet; den dødelige virkning kan også tjene som en ideell metode for knock-in og gen-erstatning studier uten de tilknyttede bivirkninger og skader av integrasjon. DNA ministring vektorer kan brukes mot overføring og uttrykket av gener for terapeutiske proteiner, RNA, antistoffer, eller antigener i et gitt mål in vivo eller erstatte en mal- eller ikke-funksjonell allel. Den enkle ett-trinns varme induserbar in vivo produksjonssystem gjør at DNA ministring vektorer for å være lett produsert for kliniske eller industrielle applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) for å finansiere dette arbeidet.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |