The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Wir konstruierten linearen kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors als nicht-virale alternative Gen-Delivery – Vektor über eine einfache Plattform in vivo produziert. DNA – Ministrings ein erhöhtes Sicherheitsprofil besitzen und auch DNA – Ladung gezielt Zellen effizient zu liefern. Herkömmliche DNA Vektoren tragen unerwünschte prokaryotische Sequenzen, einschließlich Antibiotika-Resistenzgene, CpG-Motiven und bakterielle Replikationsursprünge, die an der Stimulation der Wirtsimmunreaktionen führen können. Die Bioverfügbarkeit von herkömmlichen DNA-Vektoren wird auch aufgrund ihrer grßeren Molekülgrße kompromittiert. Ihr Kreis Natur kann auch chromosomale Integration vermitteln, zu Insertionsmutagenese führt.
Bakterielle Sequenzen werden von DNA minivectors ausgeschnitten, nur das Gen von Interesse (GOI) und notwendige eukaryotischen Expressionselemente zu verlassen. Unsere LCC DNA minivectors oder DNA-Ministrings, sind frei von immunogenen bakteriellen Sequenzen; daher die Verbesserung der thEIR Bioverfügbarkeit und GOI Ausdruck. Im Falle der Vektor-Integration in das Chromosom wird das LCC DNA MiniString- letal das Wirtschromosom zu stören, wodurch die möglicherweise gefährliche Mutante aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen. Folglich bieten DNA-Ministrings die Vorteile von 'Minicircle-' DNA, während das Potenzial für unerwünschte Vektorintegration Ereignisse zu beseitigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden und ihren isogenen Kreis kovalent geschlossene (CCC) Pendants zeigen DNA Ministrings überlegene Bioverfügbarkeit Transfektionseffizienz und cytoplasmatischen Kinetik – also sie geringere Mengen an kationischen Tensiden zur effektiven Transfektion von Zielzellen erforderlich ist.
Wir haben ein Ein-Schritt – induzierbare in vivo – System für die Herstellung von DNA – Ministrings in Escherichia coli konstruiert , das einfach zu bedienen ist , schnelle und skalierbar.
Das Ziel ist , skalierbare Mengen von linearen zu produzieren kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors mit einem einfachen und einen hohen Wirkungsgrad in einem Schritt hitzeinduzierbarer in vivo DNA MiniString- Produktionssystem. DNA-Ministrings bieten eine sichere und wirksame nicht-viralen Strategie DNA zu liefern. Sie kombinieren die Sicherheit von LCC-Vektoren mit der Effizienz von DNA-Minicircles, und bieten auch eine sicherere Alternative zu Virus-abgeleiteten Vektoren ohne Transfektionseffizienz zu beeinträchtigen.
Damit ein Transgen Verabreichungssystem erfolgreich zu sein, muss die DNA Vektor, der die Ziel-Wirtszelle ein und das codierte Transgen (e) exprimieren. Es gibt mehrere zelluläre Barrieren, die vor allem in Säugersystemen in der Praxis überwunden werden müssen. Um den Abbau durch Nukleasen und Serumimmundetektion durch retikuloendothelialen System, das DNA-Vektor muss bio- und immun kompatibel sein mit dem Zielsystem zu vermeiden. Ungeschützte DNA wird schnell durch Plasma-Nukleasen verdautund die Plasmid-Membran besteht aus dichten Lipoprotein Barrieren besteht, so dass die DNA-Vektor schnell der Lage sein muss, die Plasmamembran von Zielzellen kreuzen. Einmal in der Zelle, Vektoren müssen das Zytoplasma durchqueren und die Kernmembran durchqueren den Kern für die Transgen-Expression einzugeben. Nicht-virale Techniken Genübertragung Fokus auf Verbesserung der Gewebe- und Zell-Targeting. Jedoch verringert die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden mit diesen Techniken Transfektionseffizienz aufgrund des Vorhandenseins von immunogenen bakteriellen Sequenzen, die sich rasch Genexpression 1,2 verstummen. Herkömmliche Plasmide tragen typischerweise Antibiotika-Resistenzgene für die Wartung in prokaryotischen Systemen. Diese können jedoch mögliche schädliche Wirkungen auf menschliche Wirte produzieren oder Resistenz gegenüber natürlich vorkommenden Wirts Flora über den horizontalen Gentransfer Effekte verleihen. Herkömmliche Plasmiden auch Dinukleotid CpG – Motive 2, enthalten , die eine unerwünschte immunstimulierende Reaktion auslösen können, potenziellReduzierung oder Transgen-Expression zum Schweigen zu bringen.
Da sie nur aus den eukaryotischen Expressionskassette enthalten sind, DNA minivectors, wie DNA – Miniringe 3 sind eine bessere Alternative für die Genabgabe wie sie extrazelluläre und intrazelluläre Bioverfügbarkeit und verbesserte Genexpression aufgrund ihrer verringerten Größe und Abwesenheit von immunstimulatorischen prokaryotischen Elemente verbessert aufweisen 4. Die reduzierten Vektorgröße Tarife besser in Bezug auf Beständigkeit gegen Scherkräfte , die mit de – vivo – Verabreichung an eine Zielstelle 5. Die höhere Kopienzahl des Vektors pro Masseneinheit erfordert weniger Transfektionsreagenz, wodurch die Toxizität verringert wird. Jedoch im Falle der Zufallsvektor Integration in ein Wirtschromosom, zirkular kovalent geschlossene (CCC) Vektoren, die sowohl DNA-Miniringe und konventionellen Plasmiden, molekulare Kontinuität verleihen und damit zu Insertionsmutagenese führen kann, was verheerende Folgen haben kann <sbis> 6. Vergleichsweise, die Integration eines linearen DNA – Vektor , stört das Chromosom und initiiert Zelltod Wege, wodurch die mutierte Zelle aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen und Insertionsmutagenese 7 verhindert wird . Minimalistische immunologisch definierte Genexpression (MIDGE) Vektoren 8 und Mikro-linearen Vektoren 9 (MiLV) sind LCC DNA – Vektoren in vitro entwickelt. MIDGE – Vektoren wurden auf eine 17-fache verbessert Transgen – Expression in vivo zeigten sich im Vergleich zu herkömmlichen Plasmid – DNA – Vektoren 11 und haben vielversprechende Ergebnisse in Impfstoff 10 und Krebs 8 Gentherapie demonstriert. Darüber hinaus aufgrund der verwindungsfreie Struktur des LCC minivector weniger Transfektionsreagenz ist im Vergleich zu dem CCC supercoiled Gegenstück erforderlich, wodurch die Toxizität reduzieren 7.
Unsere verbesserte LCC DNA-Vektoren, DNA-Ministrings haben überlegen Expressionseffizienz und bioavai demonstriertLabilität 7. Weiterhin DNA Ministrings auf einem einstufigen hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem produziert, eine zweckmäßige und kostengünstige Alternative zu MIDGE und MiLV LCC – Vektoren, die in vitro mehrere Schritte erfordern. Die DNA MiniString- Produktionssystem gezeigt werden , ist eine einfache hitzeinduzierbaren Verfahren in vivo durchgeführt wird , ist es sowohl kostengünstiger und leicht skalierbar macht. Dieses System nutzt die Yersinia enterocolitica Bakteriophagen PY54-derived Tel / pal protelomerase 12 Rekombinationssystem die minimal eukaryotischen Expressionskassette aus dem prokaryotischen Plasmidrückgrat zu trennen. Wir haben Escherichia coli – Zellen entwickelt (W3NN) Tel protelomerase unter der Kontrolle des hitzeinduzierbaren Bakteriophagen – λ – Promotor, cI [Ts] 857 13 auszudrücken. Bei der Expression wirkt Tel protelomerase auf pal Zielstellen , die innerhalb "Super – Sequence" (SS) Stellen auf dem Vorläufer Plasmid befindetLCC Produkte zu ergeben, aus dem das DNA MiniString- kann dann gereinigt werden (Figur 1). Die SS – Stellen auf der DNA MiniString- Vorläufer Plasmid codieren auch Zielstellen für andere Rekombinasen einschließlich Cre – Rekombinase (LOX), TelN protelomerase (telRL) und Flp – Rekombinase (FRT), wodurch die Herstellung von isogenen LCC und CCC minivectors von einem Vorläufer – Plasmid zu erleichtern. Zusätzlich wird jede SS Seite auf beiden Seiten von SV40 – Enhancer (SV40e) Sequenzen flankiert, die dazu dienen , 14 nukleäre Translokation zu verbessern. Wir haben an anderer Stelle gezeigt , dass sukzessive Zugabe von SV40e schrittweise Erhöhungen der Transfektionseffizienz 7 verleiht. Der Vorläufer – Plasmid (pDNA MiniString- oder PDMS) enthält einen Polylinker (Abbildung 1) Einführen eines beliebigen Gens von Interesse in transkriptionale Fusion mit dem grün fluoreszierenden Reporter (GFP) zu erleichtern.
Die DNA-minivector Technologie kannanstelle von herkömmlichen Methoden für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen und Beurteilungen auf die Effizienz der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von "Mini" Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt-Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen-Transfer-Anwendung und bietet ein höheres Sicherheitsprofil.
Wir beschreiben hier ein einfaches System zur Herstellung von LCC DNA Ministrings unter Verwendung eines einstufigen hitzeinduzierbaren Protokoll, das zur Seite keine spezielle Ausrüstung erfordert, von der, die in typischen Bakterienwachstum und Manipulation verwendet wird. DNA-Ministrings sind verwindungssteife, stabile lineare DNA-Expressionskassetten, frei von prokaryotischen genetischen Elementen. Sie können anstelle von konventionellen Verfahren für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen, sowie in Abschätzungen in Richtung der Wirksamkeit der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von "Mini" Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt – de – vivo – Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen – Transfer – Anwendung ohne die Notwendigkeit für mehrere teure In – vitro – Verfahren.
Es gibt mehrere wichtige Schritte zusorgen für eine optimale MiniString- Produktion (Abbildungen 2 und 3). Wärmeinduktion ist der kritischste Schritt zur Herstellung MiniString-. Vollständiges Fehlen der Produktion von MiniString- ist höchstwahrscheinlich wegen des Mangels an Wärmeinduktion (Zellen bei 30 ° C gehalten), wo Unterdrückung der protelomerase Ausdruck Umwandlung von Vorläufer Plasmid LCC MiniString- verhindert. Im Anschluss an die Wärmeinduktion Protokoll, erwarten eine Produktionseffizienz von etwa 75%. Wärmeinduktion ist optimal, während Zellen in der log-Phase sind. Obwohl es in MiniString- PE keinen statistisch signifikanten Unterschied ist , wenn die Zellen in der stationären Phase ( "Overgrown", Abbildung 3) verwenden, haben wir fast eine 50% ige Abnahme der Gesamt Plasmidausbeute beobachten. Die Erträge werden auf der verwendeten Plasmid-Extraktionsprotokoll abhängen. Für eine optimale MiniString- Produktion auslösen Wärmeinduktion, während Zellen in der log-Phase sind. Schlechte MiniString- Produktion wird höchstwahrscheinlich ein Ergebnis einer längeren Temperatur Hoch- oder insufficie seinnt Temperatur Herunterschalten. Längerer Temperatur Hochschalten wird abgeraten , da dies der E. aktiviert coli Hitzeschockantwort 15, die protelomerase Aktivität hemmen kann und mit dem Plasmid Stabilität stören. Daher die Temperatur Herunterschalten Timing ist ein weiterer wichtiger Schritt für eine effiziente MiniString- Produktion. Ohne zusätzliche Inkubationszeit bei 30 ° C wurde MiniString- Produktionseffizienz als sehr schlecht zu sein ( "Early Removal", Abbildung 3). Dies kann auf die Menge an Zeit für Tel Expression und Aktivität erforderlich zurückzuführen. Der Ursprung Prophagen PY54 Codierung Tel protelomerase infiziert normalerweise Yersinia, die optimal wächst um 28 ° C 12, was darauf hinweist , dass 30 ° C auch für Tel Aktivität mehr optimal ist.
Die DNA – minivector Produktionssystem verwendet eine in vivo Plattform qualitativ hochwertige bakterielle Sequenz freie DNA minivectors zu erzeugen. i Modifikationen des Protokolls kannnclude die Wachstumsmedien zu verändern Plasmid und die Proteinproduktion zu optimieren, um das Zellwachstum während der Wachstumsphase (TB anstelle von LB) zu fördern, oder die Effizienz zu steigern MiniString- Produktion und Umwandlung. Für größere Kulturvolumina (200 ml und mehr), Temperatur Herunterschalten und Inkubation bei 30 ° C kann auf MiniString- PE über Nacht ohne starke negative Auswirkung verlängert werden. Wir haben als Beispiel für die 500-ml-Kulturen Änderungen in unserem Protokoll enthalten. Reinigung von DNA – Ministrings können durch in vitro – Endonuklease – Verdau des prokaryotischen Rückgrat beschleunigt werden. Es gibt eine Anzahl von Endonuclease – Zielstellen (beispielsweise PI-SceI, PvuI, ScaI) auf dem prokaryotischen Rückgrat des Vorläufers Plasmid, das geschnitten werden kann , offen linear zu belichten endet, so dass für in vitro – Abbau des prokaryotischen Rückgrat. Isolierung von Ministrings aus anderen Vektorarten können auch durch Anionenaustauschermembran – Chromatographie 16 erreicht werden.
Eine Strombegrenzung, die mit dem LCC-DNA-Vektor-Produktionssystem ist die Notwendigkeit einer Reinigung der DNA MiniString- von anderen LCC und CCC Produkte. Obwohl Verfahren unter Verwendung von Standard-Plasmidisolation leicht gereinigt, kann der Isolationsschritt noch ein Nachteil in einer groß angelegten Einstellung sein. Trennung des MiniString- kann AGE zu verwenden, wenn die Ministring und das LCC prokaryotischen Rückgrat zu ähnlich groß sein zeitraubend. Alternativ bieten kann Anionenaustauschermembran Chromatographie eine bessere Trennung von Ministrings von CCC Vektorarten 16. Temperatur Hochschalten kann eine weitere mögliche Einschränkung sein , da hohe Temperaturen auch die Hitzeschockantwort in E. aktivieren coli, das rekombinante Protein liefert 17 wirkt sich negativ auf und folglich Raten von Plasmid reduzieren Umstellung auf MiniString-. Wir berichten an anderer Stelle Optimierungen der Produktionsplattform zu umgehen und / oder zu mildern solche Effekte von Hitzeschock – 18. Wiroptimieren derzeit auch Methoden LCC Kontamination prokaryotischen Rückgrat in vivo zu beseitigen oder zu reduzieren.
Chromosomale Integration der LCC DNA MiniString- stört das Wirtschromosom und unterzieht die Zelle zur Apoptose. Nicht nur, dass diese zu reduzieren, mögliche negative Auswirkungen von Insertionsmutagenese wie oncogenesis und Silencing von benachbarten Genen, wodurch die Verbesserung ihrer Sicherheit; die letale Wirkung kann auch als ideales Verfahren zum knock-in und gene replacement Untersuchungen ohne die damit verbundenen Nebenwirkungen und Beschädigungen der Integration dienen. DNA MiniString- Vektoren können in Richtung der Transfer und die Expression von Genen für die therapeutische Proteine, RNA, Antikörper oder Antigene in einem gegebenen Ziel in vivo angewendet werden , oder eine Fehl- oder nicht – funktionelle Allel ersetzen. Die einfache Ein-Schritt hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem ermöglicht DNA MiniString- Vektoren leicht für klinische oder industrielle Anwendungen hergestellt werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) für die Förderung dieser Arbeit.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |