Çift şeritli DNA Ministrings üretimi
Summary
The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Abstract
Bu, in vivo olarak basit bir platform ile üretilen bir non-viral gene teslim vektörü alternatif olarak lineer kovalent olarak kapalı (LCC), DNA minivectors inşa edilmiştir. DNA ministrings yükseltilmiş bir güvenlik profiline sahiptir ve aynı zamanda verimli bir şekilde hedeflenen hücrelere DNA yük sağlar. Geleneksel DNA vektörleri, antibiyotik direnç genleri, CpG motifleri ve konakçı bağışıklık yanıtlarının uyarılmasına neden olabilir bakteriyel replikasyon kökeni, aşağıdakileri içeren, istenmeyen prokaryotik sekansları taşır. Geleneksel bir DNA vektörlerinin biyoyararlanım nedeniyle daha büyük bir molekül boyutuna taviz verilmektedir. Onların dairesel doğası da sokma mutajenezi neden kromozomal entegrasyon vermek olabilir.
Bakteriyel sekansları, ilgili (GOI) ve gerekli ökariyotik sentezleme elemanları, sadece gen bırakarak, DNA minivectors eksize edilir. Bizim LCC DNA minivectors veya DNA ministrings, bağışıklık bakteriyel dizilerin yoksun olan; Bu nedenle th iyileştirilmesiEIR biyoyararlanım ve GOI ifade. kromozom içine, vektör bütünleşmesinden durumunda, LCC DNA ministring öldürücü böylece proliferasyon hücre popülasyonundan tehlikeli mutantını kaldırma konakçı kromozomuna bozacaktır. istenmeyen vektör entegrasyon olaylar için potansiyel ortadan kaldırırken Sonuç olarak, DNA ministrings 'minicircle' DNA avantajlar sunuyoruz. Geleneksel plasmidler ve izogenik dairesel kovalent olarak kapalı (CCC) meslektaşları karşılaştırıldığında DNA ministrings birçok biyolojik, transfeksiyon verimi ve sitoplazmik kinetiği göstermektedir – Dolayısıyla, hedef hücrelerin etkili transfeksiyon için katyonik yüzey aktif alt ihtiyaç duyarlar.
Biz, kullanımı basit, hızlı ve ölçeklenebilir Escherichia coli DNA ministrings üretimi için in vivo sistem olarak uyanlabilir tek-aşamalı bir inşa ettiler.
Introduction
Amacı, kovalent (LCC), DNA minivectors basit ve yüksek verim tek-aşamalı ısı ile uyarılabilir İn vivo DNA ministring üretim sistemi kullanılarak kapalı doğrusal büyütülebilir miktarlarda üretilmesidir. DNA ministrings DNA teslim etmek için güvenli ve etkili bir viral olmayan bir strateji sağlar. Bunlar DNA kangallı verimlilikle LCC vektörlerinin güvenlik kombine ve aynı zamanda transfeksiyon verimi ödün vermeden virüs türevli vektörler için daha güvenli bir alternatif sunmaktadır.
başarılı olması için bir transgen dağıtım sistemi için, DNA vektörü hedef konakçı hücrenin girerek kodlanmış transgen (ler) i eksprese gerekir. Özellikle memeli sistemlerinde, uygulamada aşılması gereken çeşitli hücresel engeller vardır. retiküloendotelyal sistem serum nükleazlar ve immün tayini ile bozulmasını önlemek için, DNA vektörü hedef sisteme sahip biyolojik ve bağışıklık-uyumlu olmalıdır. Korunmasız DNA hızla plazma nükleazlar tarafından sindirilirDNA vektörü, hızla hedef hücrelerin plazma membran geçme kabiliyetine sahip olmalıdır, böylece ve plazmid membran yoğun lipoprotein bariyerleri oluşmaktadır. hücreye bir kez, vektörler sitoplazmaya hareket olması ve transgen sentezlenmesi için çekirdeğe girmek için çekirdek membranından geçerler. Viral olmayan gen iletim sistemleri doku ve hücre hedefleme geliştireceklerdir. Bununla birlikte, bu teknikler ile geleneksel plasmidlerin kullanımı nedeniyle hızlı bir şekilde gen ekspresyonu 1,2 sessizlikler imünojenik bakteriyel dizilerin varlığında transfeksiyon verimini azaltır. Konvansiyonel plazmidler genellikle prokaryotik sistemlerde bakım için antibiyotik direnç genleri taşır. Bununla birlikte, bu, insan ana olası yan etkilere ya da doğal olarak yatay gen transfer etkileri üzerinden ana florasının oluşan karşı direnci olabilir. Konvansiyonel plazmidler de potansiyel istenmeyen immünostimulan tepkisini tetikleyebilir dinükleotid CpG motifleri 2 içerenazaltılması veya transgen ekspresyonunu susturulması.
Bunlar sadece ökaryotik ekspresyon kasetinin oluşmaktadır olarak, DNA kangallı 3 DNA minivectors, dolayı azaltılmış boyut ve immünostimülatör prokaryotik elemanlarının bulunmaması da hücre dışı ve hücre içi biyolojik ve gelişmiş bir gen ekspresyonunu sergilemiştir gen dağıtımı için daha iyi bir alternatif 4. Daha iyi bir hedef bölgeye 5 in vivo tatbikat ile ilgili kesme kuvvetlerine karşı direnç ile ilgili olarak düşük vektör boyutu bileti. Birim kütle başına vektörün yüksek kopya sayısı ve böylece toksisite azaltarak daha az transfeksiyon reaktifi gerektirir. Bununla birlikte, bir konukçu kromozomu içine entegrasyon Vektör durumunda, dairesel kovalent molekül süreklilik vermek DNA kangallı geleneksel plasmidlerin her iki dahil olmak üzere (CCC) vektörleri, kapalı ve dolayısıyla yıkıcı sonuçlara sahip olabilir girmeyle mutagenez, yol açabilir <s> 6 kadar. Nispeten, lineer DNA vektörünün entegrasyonu bu şekilde çoğalan hücre popülasyonundan gelen mutant hücresidir çıkarılması ve sokma mutagenezi 7 önlenmesi, hücre ölümü, yollar kromozomu bozan ve başlatır. Minimalistic imünolojik tanımlanan gen ekspresyonu (Sineği) vektörleri 8 ve mikro doğrusal vektörleri 9 (MiLV), in vitro gelişen LCC DNA vektörleri bulunmaktadır. Sineği vektörleri bilinen plazmid DNA 11 vektörleri ile karşılaştırıldığında in vivo koşullarında, bir 17-kat daha iyi transgen ekspresyonu kadar sergiledi ve Vaccine 10 ve kanser 8 gen terapisinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Buna ek olarak, LCC minivector bükülme olmadan bir yapıya, daha az transfeksiyon reaktifi, böylece toksisite 7 indirgeyici CCC süper-muadili göre gereklidir.
Geliştirilmiş LCC DNA vektörleri, DNA'nın ministrings üstün sentezleme verimlilik ve bioavai göstermiştiroynaklığı 7. Ayrıca DNA ministrings tek-aşamalı bir ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, in vitro olarak çok sayıda basamak gerektirdiğinden tatarcık ve MiLV LCC vektörleri, bir uygun ve düşük maliyetli bir alternatif üretilmektedir. Gösterilmelidir DNA ministring üretim sistemi yapma, in vivo olarak gerçekleştirilen basit bir ısı ile indüklenebilen bir işlemdir hem de düşük maliyetli ve kolay bir şekilde büyütülebilir. Bu sistem, Yersinia enterocolitica bakteriyofaj PY54 türetilmiş Tel / PAL prokaryotik plazmid omurgasından az ökaryotik ekspresyon kaseti ayırmak için rekombinasyon sistemi 12 protelomerase patlatır. Biz ısı uyarılabilir bakteriyofaj λ promotör, cl [Ts] 857 13 kontrolü altında Tel protelomerase ifade Escherichia coli hücreleri (W3NN) tasarladık. İfade üzerine, Tel protelomerase "Süper Sırası" (SS) haberci plazmid üzerinde bulunan siteler içinde mevcut dostum hedef sitelerinde hareketDNA, ministring Daha sonra (Şekil 1) saflaştırılabilir olan LCC ürünler elde edilir. DNA, ministring ön-madde plazmid SS siteleri de böylece bir ön-madde plazmidden izogenik LCC ve CCC minivectors üretimini kolaylaştırmak Cre rekombinaz (lx), TelN protelomerase (telRL) ve Flp rekombinaz (STT) dahil olmak üzere diğer rekombinaz için hedef sitesi kodlayan. Buna ek olarak, her bir SS Alanı çekirdek translokasyonunu 14 geliştirmek için hizmet SV40 güçlendirici (SV40e) dizileri tarafından her iki yandan da taarruz edilen. Biz SV40e ardışık ilaveli kademeli Transfeksiyon etkinliğindeki 7 karşılık gelen bir artış sağladığını başka göstermiştir. Ön-madde plasmidi (pDNA MiniString veya PDMS), yeşil floresan haberci (GFP) ile transkripsiyonel füzyon daki herhangi bir istenen gen sokulmasını kolaylaştırmak için bir poli-(Şekil 1) içerir.
DNA minivector teknolojisi olabilirökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin sentezlenmesi ve değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile "mini" vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. Bizim sağlam bir adım üretim platformu hızla ve kolayca herhangi bir gen transfer uygulaması için DNA ministrings üreten ve daha yüksek bir güvenlik profili sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz tipik bakteriyel büyüme ve manipülasyonu kullanılan bu kenara özel ekipman gerektirir tek aşamalı bir ısı ile uyarılabilir bir protokol kullanılarak LCC DNA ministrings üretimi için basit bir sistem tarif eder. DNA ministrings Prokaryotik genetik elemanların yoksun torsiyonsuz ve sabit lineer DNA ekspresyon kasetleri vardır. Ökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin ekspresyonu yanı sıra değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilmektedir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile "mini" vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. In vivo üretim platformu bizim sağlam tek aşamalı hızlı ve kolay bir çok pahalı in vitro işleme gerek olmadan herhangi bir gen transfer uygulama için DNA ministrings üretir.
birkaç kritik adımlar vardırOptimal ministring üretimini (Şekil 2 ve 3) emin olun. Isı indüksiyon üretimini ministring için en kritik adımdır. üretim ministring tam olmaması nedeniyle protelomerase ifade baskı LCC ministring haberci plazmidinin dönüşüm önleyen ısı indirgemesi (30 ° C 'de muhafaza edilmiş), eksikliği muhtemeldir. Isı indüksiyon protokolü takiben, yaklaşık% 75 bir üretim verimliliğini bekliyoruz. Hücreler log fazında ise ısı indüksiyon en uygunudur. ( "Büyümüş" Şekil 3) sabit faz hücreleri kullanırken PE ministring istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmasına rağmen, biz genel plazmid verimi neredeyse% 50'lik bir azalmaya dikkat yaptı. Verim kullanılan plazmid çıkarma protokolü bağlıdır. Hücreler log fazında iken uygun ministring üretimi için, ısı indirgemesi tetikler. Kötü ministring üretimi, büyük olasılıkla uzun süreli sıcaklık yükseltme veya insufficie bir sonucu olacaktırnt sıcaklık vites küçültme. Bu E. aktive olarak uzun süreli sıcaklık vites büyütme önerilmez protelomerase aktivitesini inhibe edebilir ve plazmid stabilitesi müdahale edebilir coli ısı şokuna cevap veren 15. Bu nedenle, sıcaklık downshift zamanlama verimli ministring üretimi için bir başka kritik bir adımdır. 30 ° C 'de ek bir inkübasyon süresi olmadan ministring üretim verimliliği çok zayıf olduğu bulundu ( "erken kaldırılması", Şekil 3). Bu Tel ifade ve aktivite için gerekli olan süreyi bağlı olabilir. Menşeli profajından PY54 şifreleyen Tel protelomerase normal optimal 30 ° C de, Tel aktivitesi için daha optimum olabileceğini göstermektedir, yaklaşık 28 ° C 12 büyür Yersinia, bozar.
DNA, minivector üretim sistemi, yüksek kaliteli bakteriyel sekansı içermeyen DNA minivectors üretmek için bir in vivo platformu kullanır. protokole Değişiklikler i mayçoğalma fazı sırasında hücre büyümesini (yerine LB TB) teşvik ya da üretim ve dönüşüm etkinliğini ministring artırmak için plasmid ve protein üretimini optimize etmek için büyüme ortamı değiştirme nclude. Daha büyük kültür hacimleri (200 ml ve üzeri), sıcaklık vites küçültme ve 30 ° C'de inkübasyon için PE ministring üzerinde ciddi olumsuz etkisi olmadan bir gecede uzatılabilir. Bu örnek olarak, 500 ml kültürler için protokol taditattan. DNA ministrings saflaştırılması prokaryotik omurgası in vitro endonükleaz sindirim yoluyla hızlandırılmış olabilir. Endonükleaz, hedef siteye vardır (örneğin, PI-SceI, Pvu, Scal) açık doğrusal ortaya çıkarmak için kesilebilir ön-madde plazmid prokaryotik omurgası üzerine prokaryotik omurgasının in vitro degradasyon sağlayan, sona erer. Diğer vektör türlerden ministrings izolasyonu da anyon değiştirmeli membran kromatografisi 16 ile elde edilebilir.
LCC DNA vektörü üretim sistemi ile ilişkili bir akım sınırlama diğer LCC ve CCC ürünleri DNA ministring saflaştırılması için ihtiyaç vardır. Kolayca standart plazmid izolasyon yöntemleri kullanılarak saflaştınldı, ancak izolasyon aşaması, yine de büyük ölçekli bir ortamda bir dezavantaj olabilir. ministring ayrılması zaman alıcı ministring ve LCC prokaryotik omurga boyutu çok benzer ise AGE kullanarak olabilir. Seçenek olarak ise, anyon değiştirmeli membran kromatografisi CCC vektörü türlerinin 16 ministrings daha iyi ayrılmasını sağlayabilir. Yüksek sıcaklıklar da E. ısı şok tepki aktive olarak sıcaklık vites büyütme başka potansiyel sınırlama olabilir olumsuz rekombinant proteini etkileyen E. coli, 17 verir ve dolayısıyla dönüşüm ministring için plazmid oranlarını azaltmak. Biz üretim platformu optimizasyonları aşmak ve / veya ısı şoku 18 gibi etkilerini azaltmak için başka bir yerde rapor. BizAyrıca, şu anda ortadan kaldırmak ya da in vivo LCC prokaryotik omurga kirlenmesini azaltmak için yöntemler optimize ediyoruz.
LCC, DNA ministring kromozomal entegrasyon konak kromozomu bozar ve apoptoz hücreyi tabi. Sadece bu tür onkogenezde ve komşu genlerin susturma, böylece onun güvenliğini iyileştirilmesi gibi girmeyle mutagenez olumsuz sonuçlarını azaltmak gelmez; öldürücü etkisi, aynı zamanda ilişkili yan etkileri ve entegrasyon zarar vermeden knock-in ve gen değiştirme çalışmaları için ideal bir yöntem olarak kullanılabilir. DNA, ministring vektörleri in vivo olarak belirli bir hedef haline Terapötik proteinlerin, RNA, antikorlar veya antijenler için genlerin transferi ve ifadesi olarak uygulanacak ya da arızalara veya çalışmayan alel yerine edilebilir. Basit tek aşamalı ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, DNA ministring vektörleri kolaylıkla klinik veya endüstriyel uygulamalar için üretilen sağlar.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu çalışmayı finanse Doğal Bilimler ve Kanada (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi teşekkür ederim.
Materials
| E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
| Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
| Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
| Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
| Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
| Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
| Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
| Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
| Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
Referências
- Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
- Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
- Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
- Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
- Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
- Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
- Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
- Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
- Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
- López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
- Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
- Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
- Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).
- Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
- Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
- Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).
