Производство двухцепочечной ДНК Ministrings
Summary
The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Abstract
Мы построили линейные ковалентно замкнутые minivectors (LCC) ДНК в качестве невирусных генов доставки вектора альтернативы производится с помощью простой платформы в естественных условиях. Ministrings ДНК обладают повышенный профиль безопасности , а также эффективно доставлять груз в ДНК клеток – мишеней. Обычные ДНК-векторы несут нежелательные прокариотические последовательности, включая гены устойчивости к антибиотикам, CpG мотивов и бактериальными начала репликации, что может привести к стимуляции реакций хозяина иммунологических. Биодоступность обычных ДНК-векторов, осложнен из-за их больших размеров молекул. Их круговая природа может также придавать хромосомной интеграции, что приводит к инсерционного мутагенеза.
Бактериальные последовательности вырезают из minivectors ДНК, оставляя только интерес ген (ГОИ) и необходимых элементов эукариотических экспрессии. Наши LCC ДНК minivectors или ministrings ДНК, лишенные иммуногенных бактериальных последовательностей; Поэтому улучшение е местоEIR биодоступности и ГОИ выражение. В случае вектора интеграции в хромосому, то ministring LCC ДНК будет летально разрушают хромосому хозяина, тем самым удаляя потенциально опасный мутант из популяции пролиферирующих клеток. Следовательно, ministrings ДНК предлагают преимущества 'minicircle' ДНК, устраняя потенциал для нежелательных событий вектор интеграции. По сравнению с обычными плазмидами и их изогенных круговыми, ковалентно замкнутых (КТС) аналоги, ministrings ДНК демонстрируют превосходную биологическую доступность, эффективность трансфекции и цитоплазматический кинетика – таким образом, что они требуют меньших количеств катионных поверхностно-активных для эффективной трансфекции клеток-мишеней.
Мы построили один шаг индуцируемой в системе естественных условиях для производства ministrings ДНК в кишечной палочки, которая проста в использовании, быстрым и масштабируемым.
Introduction
Цель состоит в том, чтобы производить масштабируемых количества линейных ковалентно замкнутой (LCC) ДНК minivectors с использованием простой и высокоэффективный одностадийный тепла , индуцируемого естественных условиях ДНК системы производства ministring в. ministrings ДНК обеспечивают безопасную и эффективную невирусный стратегию для доставки ДНК. Они сочетают в себе безопасность векторов LCC с эффективностью minicircles ДНК, а также предложить более безопасную альтернативу вирусные полученные векторы без ущерба для эффективности трансфекции.
Для того, чтобы система доставки трансгенов, чтобы быть успешным, вектор ДНК должна проникать в клетку-хозяина целевой и выражают кодированный трансген (ы). Есть несколько клеточные барьеры, которые необходимо преодолеть на практике, в частности, в системах млекопитающих. Для того чтобы избежать деградации при добавлении сыворотки нуклеаз и иммунной обнаружения с помощью ретикулоэндотелиальной системы, вектор ДНК должна быть био- и иммунной совместимостью с целевой системой. Незащищенный ДНК быстро усваиваются плазмы нуклеази плазмида мембрана состоит из плотных липопротеинов барьеров поэтому ДНК-вектор должен быть способен быстро пересекая плазматическую мембрану клеток-мишеней. После того, как в клетке, векторы должны пройти через цитоплазму и проходят через ядерную мембрану, чтобы войти в ядро для трансгенной экспрессии. Невирусные методы доставки генов сосредоточиться на повышении ткане и клеточной ориентации. Тем не менее, применение обычных плазмид с этими методами снижает эффективность трансфекции в связи с наличием иммуногенных бактериальных последовательностей, которые быстро Silences экспрессию гена 1,2. Обычные плазмиды, как правило, несут гены устойчивости к антибиотикам для поддержания в прокариотических системах. Тем не менее, это может привести к потенциально опасное воздействие на человека хостах или придавать устойчивость к природе хозяев флоры с помощью горизонтальных эффектов переноса генов. Обычные плазмиды также содержат динуклеотид CpG мотивы 2, которые могут вызвать нежелательную реакцию иммуностимулирующее, потенциальноуменьшения или глушителей экспрессии трансгена.
Поскольку они исключительно состоят из эукариотической экспрессионной кассеты, ДНК minivectors, такие как ДНК minicircles 3, являются лучшей альтернативой для доставки гена, они имеют улучшенные характеристики внеклеточную и внутриклеточную биодоступностью и улучшенную экспрессию гена из – за их уменьшенного размера и отсутствием иммуностимулирующих прокариотических элементов 4. Пониженные тарифы размер вектора лучше по отношению к устойчивости к касательных сил , связанных с введением в естественных условиях на целевом сайте 5. Чем выше число копий вектора на единицу массы требует меньшего количества реагента для трансфекции, что приводит к снижению токсичности. Тем не менее, в случае случайного вектора интеграции в хромосому хозяина, циркулярно ковалентно закрыт (CCC) векторов, включая как minicircles ДНК и обычных плазмид, придают молекулярную непрерывность и, следовательно, может привести к инсерционного мутагенеза, который может иметь разрушительные последствия <sдо> 6. Для сравнения, интеграция линейного вектора ДНК разрушает хромосомы и инициирует пути клеточной гибели, тем самым удаляя мутантной клетки из пролиферирующих популяции клеток и предотвращения инсерционного мутагенеза 7. Минимализма иммунологически определяется экспрессия генов (Midge) векторов 8 и микро-линейных векторов 9 (MiLV) представляют собой векторы LCC ДНК , разработанные в лабораторных условиях . Векторы Мидж выставлен до улучшения экспрессии трансгенов в 17-кратном в естественных условиях по сравнению с обычными плазмидной ДНК векторы 11, и показали обнадеживающие результаты в вакцине 10 и рак 8 генной терапии. Кроме того, из – за кручения структуры LCC minivector, и меньшее количество реагента для трансфекции требуется по сравнению с CCC суперспирализована аналога, тем самым снижая токсичность 7.
Наши усовершенствованные векторы LCC ДНК, ministrings ДНК, продемонстрировали высокую эффективность экспрессии и bioavaiлабильность 7. Кроме того, ministrings ДНК производятся на тепловыделяющей индуцибельная естественных условиях производственной системы в одностадийном, целесообразной и экономически эффективной альтернативой Мидж и MiLV LCC векторы, которые требуют несколько этапов в пробирке. Производственная система ministring ДНК должна быть продемонстрирована простой тепловой индуцируемого процесс , выполняемый в естественных условиях, что делает его экономически более эффективно и легко масштабируются. Эта система эксплуатирует Yersinia энтероколитные бактериофага PY54 происхождения Tel / дружище protelomerase система 12 рекомбинации , чтобы отделить минимальную эукариотической кассету экспрессии из прокариотической плазмиды позвоночника. Мы проектировали клетки кишечной палочки (W3NN) , чтобы выразить Tel protelomerase под контролем теплового индуцируемого промотора бактериофага Х, či [Ts] 857 13. При экспрессии, Тель protelomerase действует на целевых сайтах дружище , присутствующих в "Супер Sequence" (SS) участков , расположенных на плазмиде предшественникас получением LCC продуктов, из которых ministring ДНК затем может быть очищен (рисунок 1). Участки SS на плазмиде предшественника ministring ДНК также кодируют целевые сайты для других рекомбиназ включая Cre рекомбиназой (LOX), символ TELN protelomerase (telRL) и Flp рекомбиназой (FRT), облегчая тем самым производство изогенных LCC и КТС minivectors из одной плазмиды – предшественника. Кроме того, каждый узел СС примыкают с обеих сторон энхансер SV40 (SV40e) последовательностей, которые служат для улучшения ядерной транслокации 14. Мы показали в другом месте , что последовательное добавление SV40e постепенно дает соответствующее увеличение эффективности трансфекции 7. Плазмида предшественник (пДНК MiniString или PDMS) содержит полилинкер (рисунок 1) для облегчения введения любого желаемого гена интереса к транскрипционной слияния с зеленым флуоресцентным репортер (GFP).
ДНК minivector технология можетиспользоваться вместо обычных методов переноса генов, экспрессию репортерных генов, а также оценки в отношении эффективности трансгенной экспрессии в эукариотических системах. ministrings ДНК сочетают биосовместимость и увеличение возможности повышения эффективности трансфекции векторов "мини" с превосходным профилем безопасности линейных ДНК-векторов. Наш надежный один шаг платформы производства быстро и легко производит ministrings ДНК для любого применения переноса генов и предлагает более высокий профиль безопасности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем простую систему для производства ministrings LCC ДНК с использованием тепла, индуцируемого протокол один шаг, который не требует никакого специального оборудования, кроме той, которая используется в типичных роста бактерий и манипуляций. ministrings ДНК без кручения, стабильные линейные экспрессии ДНК кассеты, лишенные прокариотических генетических элементов. Они могут быть использованы вместо обычных методов переноса генов, экспрессию репортерных генов, а также в оценках в отношении эффективности трансгенной экспрессии в эукариотических системах. ministrings ДНК сочетают биосовместимость и увеличение возможности повышения эффективности трансфекции векторов "мини" с превосходным профилем безопасности линейных ДНК-векторов. Наш надежный один шаг в естественных условиях эксплуатационной платформы быстро и легко производит ministrings ДНК для любого применения переноса гена без необходимости использования нескольких дорогостоящих процессов в лабораторных условиях .
Есть несколько важных шагов кобеспечить оптимальное производство ministring (цифры 2 и 3). Тепло индукции является наиболее важным шагом на пути к ministring производства. Полное отсутствие ministring производства, скорее всего, из-за отсутствия индукции тепла (клетки сохранившие при 30 ° С), где подавление экспрессии protelomerase предотвращает превращение плазмиды-предшественника к LCC ministring. После индукции протокола тепла, ожидать эффективности производства примерно на 75%. Тепло индукции является оптимальным в то время как клетки в логарифмической фазе. Хотя нет статистически значимой разницы в ministring PE при использовании клеток в стационарной фазе ( "Заросший", рисунок 3), мы сделали наблюдать почти уменьшение общего выхода плазмиды 50%. Урожайность будет зависеть от протокола экстракции плазмиды, использованной. Для оптимального производства ministring, вызвать индукционного нагрева в то время как клетки в логарифмической фазе. Плохое производство ministring, скорее всего, является результатом длительной температуры повышающей или Недостатнт температура понижающей передачи. Длительная температура повышенной передачи не рекомендуется , так как это активизирует E. палочка ответ 15 теплового шока, который может ингибировать активность protelomerase и мешать стабильности плазмиды. Таким образом, выбор времени температуры пониженную является еще одним важным шагом для эффективного производства ministring. Без дополнительного времени инкубации при 30 ° С, ministring эффективность производства было обнаружено, что очень плохо ( "раннее удаление", рисунок 3). Это может быть связано с количеством времени, необходимого для выражения Tel и активности. Происходящий Профаг кодирование PY54 Тел protelomerase обычно инфицирует Yersinia, который оптимально около 28 произрастает ° С 12, что указывает на 30 ° C также может быть более оптимальным для Тель – активности.
Производственная система ДНК minivector использует платформу в естественных условиях для создания высококачественных бактериальных последовательностей свободных minivectors ДНК. Изменения в протоколе может яNCLUDE изменения питательной среды для оптимизации плазмиды и продуцирования белка в целях стимулирования роста клеток во время фазы роста (ТБ вместо LB), или увеличить ministring производства и преобразования эффективности. Для больших объемов культуры (200 мл и больше), температура пониженную и инкубирования при 30 ° С, может быть продлен в течение ночи без сильного негативного воздействия на ministring PE. Мы включили изменения в нашем протоколе на 500 мл культур, в качестве примера. Очистка ministrings ДНК может быть ускорен путем переваривания ин витро эндонуклеазы прокариотических позвоночника. Есть целый ряд эндонуклеаз сайтов – мишеней (например, PI-SCEI, PvuI, ScaI) доступны на прокариотической цепи плазмиды – предшественника, которую можно разрезать , чтобы выставить открытые линейные концы, что позволяет деградации в пробирке прокариот позвоночника. Выделение ministrings из других видов вектор также может быть достигнуто с помощью анионообменной хроматографии мембраны 16.
Один ограничение тока, связанный с системой векторного производства LCC ДНК является необходимость очистки ministring ДНК из других LCC и CCC продуктов. Хотя легко очищают с помощью стандартных методов выделения плазмид, стадии выделения по-прежнему может быть недостатком в условиях крупномасштабной. Разделение ministring может отнимать много времени, используя AGE, если ministring и прокариотической позвоночник LCC слишком похожи по размеру. В качестве альтернативы, анионообменной хроматографии мембраны может обеспечить лучшее разделение ministrings от CCC вида переносчиков 16. Температура может быть повышенной передачи другим потенциальным ограничением , как высокие температуры также активирует реакцию теплового шока в E. палочка, которая негативно влияет на рекомбинантный белок дает 17 и , следовательно , привести к снижению уровня плазмиды ministring преобразования. Мы сообщаем о других оптимизаций производственной платформы , чтобы обойти и / или смягчения таких последствий теплового шока 18. МыТакже в настоящее время методы оптимизации для устранения или уменьшения загрязнения LCC прокариотической магистральную в естественных условиях.
Хромосомная интеграция ministring LCC ДНК разрушает хромосомы хозяина и подвергает клетки к апоптозу. Это не только уменьшить потенциальные негативные последствия инсерционного мутагенеза, таких как онкогенеза и глушителей соседних генов, тем самым улучшая его безопасность; летальный эффект может также служить в качестве идеального способа забивные и замены гена исследований без сопутствующих побочных эффектов и повреждения интеграции. ДНК ministring векторы могут быть применены к передаче и экспрессии генов для терапевтических белков, РНК, антител или антигенов в данной мишени в естественных условиях или заменить ее неправильному или нефункциональные аллеля. Простой один шаг тепла , индуцируемого в естественных условиях производственная система позволяет ДНК ministring векторы быть легко получены для клинического или промышленного применения.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят естественных и технических наук Научно-исследовательский совет Канады (NSERC) для финансирования этой работы.
Materials
| E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
| Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
| Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
| Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
| Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
| Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
| Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
| Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
| Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
Referências
- Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
- Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
- Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
- Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
- Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
- Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
- Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
- Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
- Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
- López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
- Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
- Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
- Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).
- Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
- Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
- Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).
