The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Vi konstruerede lineære kovalent lukket (LCC) DNA minivectors som en ikke-viral gen-overførselsvektor alternativ produceret via en simpel platform in vivo. DNA ministrings besidder en øget sikkerhedsprofil og også effektivt levere DNA last til målrettede celler. Konventionelle DNA-vektorer bærer uønskede prokaryote sekvenser, herunder antibiotiske resistensgener, CpG-motiver, og bakterielle replikationsstartområder, som kan føre til stimulering af værtens immunologiske reaktioner. Biotilgængeligheden af konventionelle DNA-vektorer er også kompromitteret på grund af deres større molekylstørrelse. Deres cirkulære natur kan også bibringe kromosomal integration, der fører til insertionsmutagenese.
Bakterielle sekvenser udskæres fra DNA minivectors, så kun genet af interesse (GOI) og nødvendige eukaryote ekspressionselementer. Vores LCC DNA minivectors eller DNA ministrings, er blottet for immunogene bakterielle sekvenser; derigennem forbedre thEIR biotilgængelighed og indiske regering udtryk. I tilfælde af vektor integration i kromosomet, vil LCC DNA ministring letalt forstyrre værtskromosomet og derved fjerne det potentielt farlige mutanten fra prolifererende cellepopulation. Derfor DNA ministrings tilbyder fordelene ved "minicircle 'DNA samtidig fjerne muligheden for uønskede vektor integration begivenheder. I sammenligning med konventionelle plasmider og deres isogene cirkulære kovalent lukkede (CCC) modstykker, DNA ministrings demonstrerer overlegen biotilgængelighed, transfektionseffektivitet, og cytoplasmiske kinetik – de derfor kræver mindre mængder af kationiske overfladeaktive midler til effektiv transfektion af målceller.
Vi har konstrueret en et-trins inducerbar in vivo-system til produktion af DNA ministrings i Escherichia coli, som er enkel at anvende, hurtig og skalerbar.
Målet er at fremstille skalerbare mængder lineær kovalent lukket (LCC) DNA minivectors hjælp af en simpel og høj effektivitet ettrins varme-inducerbar in vivo DNA ministring produktionssystem. DNA ministrings giver en sikker og effektiv ikke-viral strategi til at levere DNA. De kombinerer sikkerheden af LCC vektorer med effektiviteten af DNA minicircles, og tilbyder også et sikrere alternativ til virusafledte vektorer uden at kompromittere transfektionseffektivitet.
For at et transgen leveringssystem skal lykkes, skal DNA-vektoren ind i target værtscelle og udtrykke det kodede transgen (er). Der er flere cellulære barrierer, der skal overvindes i praksis, især i mammale systemer. For at undgå nedbrydning af serumnukleaser og immune påvisning ved retikuloendoteliale system skal DNA-vektoren være bio- og immun-kompatibel med målsystemet. Ubeskyttet DNA hurtigt fordøjet af plasma nukleaserog plasmidet membran består af tætte lipoprotein barrierer, så DNA-vektoren skal være i stand til hurtigt at krydse plasmamembranen af målceller. Når i cellen, skal vektorer krydse cytoplasmaet og passerer gennem kernemembranen at trænge ind i kernen for transgenekspression. Ikke-virale gen levering teknikker fokus på forbedring af vævs- og celle-targeting. Men anvendelsen af konventionelle plasmider med disse teknikker reducerer transfektionseffektiviteten på grund af tilstedeværelsen af immunogene bakterielle sekvenser, som hurtigt tavshed genekspression 1,2. Konventionelle plasmider typisk bære antibiotikaresistensgener for vedligeholdelse i prokaryote systemer. Dog kan disse producere potentielle negative virkninger i humane værter eller give resistens over for naturligt forekommende vært flora via horisontal genoverførsel effekter. Konventionelle plasmider indeholder også dinukleotid CpG-motiver 2, der kan udløse en uønsket immunstimulatorisk respons, potentieltreducere eller silencing transgenekspression.
Da de udelukkende består af den eukaryote ekspressionskassette, DNA minivectors, såsom DNA minicircles 3, er et bedre alternativ for genafgivelse de udviser forbedret ekstracellulær og intracellulær biotilgængelighed og forbedret genekspression på grund af deres reducerede størrelse og fravær af immunstimulerende prokaryote elementer fire. De reducerede vektor størrelse billetpriser bedre med hensyn til resistens over for forskydningskræfter i forbindelse med in vivo-indgivelse til et målsted 5. Den højere kopiantal af vektoren pr masseenhed kræver mindre transfektionsreagens og dermed reducere toksicitet. Men i tilfælde af tilfældig vektor integration i et værtskromosom, cirkulært kovalent lukkede (CCC) vektorer, herunder begge DNA minicircles og konventionelle plasmider, bibringer molekylær kontinuitet og derfor kan føre til insertionsmutagenese, hvilket kan have katastrofale følger <sop> 6. Forholdsvis, integration af en lineær DNA-vektor forstyrrer kromosomet og initierer celledødsveje og derved fjerne den mutante celle fra prolifererende cellepopulation og forebyggelse insertionsmutagenese 7. Minimalistiske immunologisk definerede genekspression (Midge) vektorer 8 og mikro-lineære vektorer 9 (MiLV) er LCC-DNA-vektorer, der er udviklet in vitro. Midge vektorer har udstillet op til en 17-fold forbedret transgen ekspression in vivo forhold til konventionelle plasmid-DNA vektorer 11, og har vist lovende resultater i vaccine 10 og kræft 8 genterapi. Desuden, på grund af vridning-fri struktur af LCC minivector, er mindre transfektionsreagens kræves i forhold til CCC supersnoet modstykke, hvilket reducerer toksiciteten 7.
Vores forbedrede LCC-DNA-vektorer, DNA ministrings, har vist overlegen udtryk effektivitet og bioavailabilitet 7. Endvidere er DNA ministrings produceret på en et-trins varme-inducerbar in vivo produktionssystem, et effektivt og omkostningseffektivt alternativ til Midge og MiLV LCC vektorer, som kræver flere trin in vitro. DNA ministring produktionssystem, der skal påvises er et simpelt varme-inducerbar proces udføres in vivo, hvilket gør det både omkostningseffektiv og let skalerbar. Dette system udnytter Yersinia enterocolitica bakteriofag PY54-afledt Tel / pal protelomerase rekombination systemet 12 for at adskille den minimale eukaryote ekspressionskassetten fra det prokaryote plasmidskelet. Vi har manipuleret Escherichia coli-celler (W3NN) at udtrykke Tel protelomerase under styring af varmen-inducerbare bakteriofag λ promotor, cl [Ts] 857 13. Ved udtryk, Tlf protelomerase virker på kammerat målområderne stede i "Super Sequence" (SS) sites placeret på forstadiet plasmidettil opnåelse LCC produkter, hvorfra DNA ministring derefter kan oprenses (figur 1). SS steder på DNA ministring forløber plasmid også kode målområder for andre rekombinaser herunder Cre rekombinase (lox), TelN protelomerase (telRL) og Flp rekombinase (FRT), hvilket letter produktionen af isogene LCC og CCC minivectors fra en forløber plasmid. Derudover er hver SS websted flankeret på begge sider med SV40 enhancer (SV40E) sekvenser, som tjener til at forbedre den nukleare translokation 14. Vi har vist et andet sted at successiv tilsætning af SV40E gradvist giver tilsvarende stigninger i transfektionseffektiviteten 7. Precursor plasmid (pDNA MiniString eller PDMS) indeholder en polylinker (figur 1) for at lette indføring af enhver ønsket gen af interesse i transkriptionel fusion med det grønt fluorescerende reporter (GFP).
DNA minivector teknologi kananvendes i stedet for konventionelle fremgangsmåder til genoverførsel, ekspression af reportergener, og vurderinger i retning af effektiviteten af transgen ekspression i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og øget transfektion effektivitetsfordele, som "mini" vektorer med den overlegne sikkerhedsprofil for lineære DNA-vektorer. Vores robuste en-trin produktionsplatform hurtigt og nemt producerer DNA ministrings for enhver genoverførsel ansøgning og tilbyder en højere sikkerhedsprofil.
Vi beskriver her et simpelt system til produktion af LCC DNA ministrings bruger ettrins varme-inducerbar protokol, der kræver ikke særligt udstyr bortset fra den, der anvendes i typisk bakterievækst og manipulation. DNA ministrings er torsion-fri, stabile lineære DNA ekspressionskassetter, blottet for prokaryote genetiske elementer. De kan anvendes i stedet for konventionelle fremgangsmåder til genoverførsel, ekspression af reportergener, samt i vurderinger i retning af effektiviteten af transgen ekspression i eukaryote systemer. DNA ministrings kombinere biokompatibilitet og øget transfektion effektivitetsfordele, som "mini" vektorer med den overlegne sikkerhedsprofil for lineære DNA-vektorer. Vores robuste et-trins in vivo produktionsplatform hurtigt og nemt producerer DNA ministrings for enhver genoverførsel ansøgning uden behov for flere dyre in vitro processer.
Der er flere kritiske trin tilsikre en optimal ministring produktion (figur 2 og 3). Varmeinduktion er den mest kritiske trin til ministring produktion. Fuldstændig mangel på ministring produktion er mest sandsynligt på grund af mangel på varme induktion (celler tilbageholdt ved 30 ° C), hvor undertrykkelse af protelomerase ekspression forhindrer omdannelse af precursor plasmidet til LCC ministring. Efter varme induktionsprotokol, forventer en produktionseffektivitet på ca. 75%. Varmeinduktion er optimal mens cellerne er i log-fase. Selvom der ikke er nogen statistisk signifikant forskel i ministring PE ved brug celler i stationær fase ( "Tilgroet", figur 3), gjorde vi observere næsten et fald i den samlede plasmidudbytte 50%. Udbytter vil afhænge af plasmid ekstraktion anvendte protokol. For optimal ministring produktion, udløser varme induktion mens celler er i log-fase. Dårlig ministring produktionen vil højst sandsynligt være et resultat af langvarig temperatur upshift eller insufficient temperatur downshift. Langvarig temperatur upshift frarådes, da dette aktiverer E. coli varmechok respons 15, som kan inhibere protelomerase aktivitet og forstyrre plasmidstabilitet. Derfor timing temperaturen downshift er endnu et afgørende skridt til effektiv ministring produktion. Uden yderligere inkubationstid ved 30 ° C, blev ministring produktionseffektivitet sig at være meget fattige ( "Early Removal", figur 3). Dette kan tilskrives den tid, der kræves til Tel ekspression og aktivitet. Den oprindelse profag PY54 kodning Tel protelomerase inficerer normalt Yersinia, som optimalt vokser omkring 28 ° C 12, hvilket indikerer, at 30 ° C også kan være mere optimalt for Tel aktivitet.
DNA minivector produktion system anvender en in vivo platform til at generere høj kvalitet bakterielle sekvens-fri DNA minivectors. Ændringer af protokollen kan jegnclude ændring af vækst- medier for at optimere plasmid og proteinproduktion for at fremme cellevækst under vækstfasen (TB stedet for LB), eller øge ministring fremstilling og forarbejdning effektivitet. Til større mængder kultur (200 ml og større), temperatur nedgearing og inkubation ved 30 ° C, kan forlænges natten uden alvorlige negative følger for ministring PE. Vi har medtaget ændringer i vores protokol for 500 ml kulturer som et eksempel. Oprensning af DNA ministrings kan fremskyndes gennem in vitro-spaltning af den prokaryote rygrad. Der er en række endonuklease målsteder (fx PI-Scel, Pvul, Scal) til rådighed på det prokaryote rygraden i precursor plasmid, som kan skæres for at blotlægge åben lineær ender, hvilket muliggør in vitro nedbrydning af den prokaryote rygrad. Isolering af ministrings fra andre vektorarter kan også opnås gennem anionbytningsmembran kromatografi 16.
En strømbegrænsning forbundet med LCC DNA-vektoren produktionssystem er behovet for oprensning af DNA ministring fra andre LCC og CCC produkter. Selvom let oprenses ved anvendelse af standard plasmid isoleringsmetoder, kan isoleringstrinnet stadig være en ulempe i en storstilet indstilling. Adskillelse af ministring kan være tidskrævende at bruge AGE hvis ministring og LCC prokaryote rygrad er for ens i størrelse. Alternativt kan anionbytningsmembran kromatografi give bedre adskillelse af ministrings fra CCC vektorarter 16. Temperatur upshift kan være en anden potentiel begrænsning, så høje temperaturer også aktivere varmechok-respons i E. coli, som krænker rekombinant protein giver 17 og dermed reducere satserne for plasmid til ministring konvertering. Vi rapporterer andre steder optimeringer af produktionen platform til at omgå og / eller afbøde sådanne virkninger af varme chok 18. Vier også i øjeblikket at optimere metoder til at fjerne eller reducere LCC prokaryot rygrad forurening in vivo.
Kromosomal integration af LCC DNA ministring forstyrrer værtskromosomet og underkaster cellen for apoptose. Dette er ikke blot reducere eventuelle negative konsekvenser af insertionsmutagenese såsom onkogenese og lyddæmpning af tilstødende gener, og derved forbedre dets sikkerhed, den letale virkning kan også tjene som en ideel metode til knock-in og generstatningsteknikker studier uden de associerede bivirkninger og skader af integration. DNA ministring vektorer kan blive anvendt til overførsel og ekspression af gener til terapeutiske proteiner, RNA, antistoffer eller antigener i et givet mål in vivo eller erstatte en fejl- eller ikke-funktionel allel. Den enkle ettrins varme-inducerbar in vivo-fremstilling system tillader DNA ministring vektorer til at let fremstilles til kliniske eller industrielle applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC) til finansiering dette arbejde.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |