Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massiver diaphysären Knochendefekte sind eine große Herausforderung für den orthopädischen Chirurgen. Knochenersatz mit autologem Knochentransplantat, als derzeit als Gold-Standard-Behandlung ist nur in begrenztem Umfang und ist im Zusammenhang mit der Ernte-bedingten Morbidität. Aus diesen Gründen Tissue-Engineering Knochenkonstrukte Knochenmark mesenchymale Stammzellen mit osteokonduktiven Gerüste kombiniert wurden als Alternative für autologe in der orthopädischen Chirurgie erforscht.
Bis heute wurden in klinisch relevanten Tiermodellen wie Hunde, Schweine und Schafe 1-3, aber vorläufige Bewertung dieser Konstrukte in orthotoper, segmentale, kritische Größe von Knochendefekten in Kleintiermodellen (wie ausgeführt die meisten Studien Mäuse) kann mehrere Vorteile aufweisen: (i) geringe Kosten, (ii) eine große Anzahl von Tieren betrieben werden kann; (Iii) im Gegensatz zu Großtiermodellen, Homogenität der Mausstämme begrenzt individuellen Schwankungen in ein Gerüst Resorptionnd Knochenbildung und; (Iv) am wichtigsten ist, die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern und Gen-Zieltiere ermöglichen die Bewertung des biologischen Prozesses in Knochenheilung beteiligt. Last but not least Verwendung von immundefizienten Mäusestämme können auch Studien entweder Transplantate oder Zellen menschlichen Ursprungs ohne nachteilige Immunreaktionen in Mäusen.
Trotz der oben genannten Vorteile, massiven diaphysär Modelle Knochendefekt bei Mäusen sind spärlich. Die meisten dieser Modelle verwenden Knochenfixierung mit einem Marknagel, der die Knochenmarkshöhle füllt ( und somit das Volumen des Materials zu begrenzen getestet werden) und verhindert auch die Reproduzierbarkeit von nicht Rotations- und axiale Stabilität 2,4-7 bereitstellt.
Die Ziele der aktuellen Studie sind (i) eine klinische Knochen nicht gewerkschaftlich Situation nachahmt, eine reproduzierbare, kritische Größe, segmentale, Oberschenkeldefektmodell in Mäusen zu beschreiben, die durch genaue und reproduzierbare Verriegelungsplatte osteosynth stabilisiertesis , die 8-10 eine sehr stabile biomechanische Umgebung zur Verfügung stellt; (Ii) zu veranschaulichen das vorliegende Modell mit zwei potentiellen Knochenersatz und Knochenbildung zu beschreiben Analysen, die verwendet werden könnten.
Ectopic Implantation von orthopädischen bezogenen Materialien und Geräte in Mäusen wird üblicherweise durchgeführt , die Knochen bilden Kapazitäten verschiedener Gerüste 13,14 zu beurteilen. Wichtige Unterschiede bestehen jedoch zwischen Extrauteringravidität und orthotoper Modelle, einschließlich nativer osteogene Signalfaktoren und parakrine Interaktionen mit Hostknochenbildenden Zellen.
Die vorliegende Studie stellt eine reproduzierbare murine große segmentale, kritische Größe Oberschenkel Defekt (3,5 mm, ca. 20-25% des Oberschenkels Länge). atrophischen Knochen nicht gewerkschaftlich In Anbetracht der Größe eines solchen Mangels und die durch die resultierende Platte Osteosynthese vorgesehen Stabilität ahmt dieses Modell die klinisch festgestellt.
Die postoperativen Zeitraum in der vorliegenden Studie ausgewählt, steht im Einklang mit den zuvor beschriebenen nicht gewerkschaftlich Modelle Mäuse, einen Mangel an ausreichenden Heilung nach 8 bis 12 Wochen 4,9,15,16 zeigt.
Am wichtigsten ist, reproducible und stabile Osteosynthese sowie Stabilität der implantierten Knochenersatzmaterialien wurden ohne eine signifikante Morbidität und Mortalität erhaltenen 1,2 mit der Verwendung von sowohl Verriegelungsplatte und eine Spannvorrichtung , die Ostektomie auszuführen. Dieses Ergebnis steht auch im Gegensatz die Ergebnisse berichtet , wenn entweder ein Fixateur externe oder ein Marknagel 4,5,17-24 verwendet wurden. Für die externen Fixatoren möglichen Nachteile sind: die Variabilität in der Steifigkeit, Infektionen der Stifte flächen, der Stifte Lösen Potentialen Verletzungen durch die Stifte und das Gewicht der Materialien (4 bis 20% des Mauskörpergewicht). Für den Marknagel potentielle Nachteile umfassen: Befüllen der Markhöhle mit dem Nagel und iatrogene Schädigung der Gelenkflächen.
Andere Maus – Segment-kritische Größe femoralis durch Plattenosteosynthese stabilisiert Defekte wurden mit Knochendefekt durch einen Grat erstellt beschrieben und im Bereich von 1,5 bis 2 mm Länge 16,25. in thvorliegende Modell e, die Verwendung einer Schablone und einem Sägedraht erlaubt eine präzise 3,5 mm langen Ostektomie ohne wesentliche Muskeln Trauma.
Doch um erfolgreich zu sein, das Verfahren bei der Durchführung einer auf die Prüfung mehrere wichtige Punkte nehmen sollte: nicht kleine Mäuse (Nude Mäuse entweder mit einem Gewicht unter 25 g oder Alter unter 8 Wochen) sonst die Platte sollte zu lang sein anwenden. kaudal und die Gelenkkapsel nach distal Wenn die Oberschenkelknochen nähert, kümmern uns sowohl den Ischiasnerv zu bewahren. Tragen Sie die Platte auf der Vorderseite des Oberschenkelknochens und da die Ausrichtung der Platte durch Anwendung dieser ersten Schraube bestimmt wird, achten Sie darauf, die Platte parallel zum Femur zu positionieren, wenn diese erste Schraube einsetzen.
Bevor die Ostektomie machen, kümmern sich eine kreisförmige Präparation des Oberschenkels in der Mitte der Diaphyse durchführen Muskeltrauma zu vermeiden. Wenn die Ostektomie durchführen, müssen den Assistenten des Chirurgen halten fest, die Führung und die surgeon muss vorsichtig (i) die Säge nicht Draht zu verwirren, (ii) die mittleren zwei Drittel des Drahtes zu verwenden, während eine konstante stetige Spannung aufbringt und (iii) überschüssige Bewegung zu vermeiden, einen geraden Knochenschnitt zu erhalten.
Die Knochenheilung ist möglich, in das vorliegende Modell ein Knochentransplantat verwendet wird, zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell weitere Studien der Mechanismen in Knochenersatzstrategien, wenn entweder menschlichen Ursprungs-Transplantate oder Zellen in einem gut standardisiert, groß, segmental, Knochendefekt eingesetzt werden.
Darüber hinaus Verfeinerung und Reduzierung der Verwendung von Tieren in der Orthopädie bezogenen Forschung in Einklang zu aktuellen Trends erfordern, kann dieses Modell mit in vivo Bildgebungstechniken wie Biolumineszenz in Verbindung verwendet werden. Eine solche nicht-invasive Techniken ermöglichen die Überwachung sowohl implantiert das Überleben von Zellen und Gewebeheilung ohne 26 Tieropfer erfordern.
Wesentliche Einschränkungen des vorliegenden Modells sind sowohl dieTragbedingungen und das Volumen des Knochendefekt erzeugt, da sie mit denen begegnet klinisch beim Menschen nicht vollständig nachahmen. Weitere Einschränkungen des Modells sind (i) die Strahlenundurchlässigkeit der Platte , die Entfernung der Platte erfordern, bevor ex vivo μCT Analyse und kann die Interpretation der Längsröntgenuntersuchung Ergebnisse erschweren und, (ii) die Unfähigkeit , Tellersteifigkeit zu modulieren , die kann sein 27-30 ein wichtiger mechanischer Parameter bei der Knochenbildung.
Man muss auch bedenken, wenn entweder Knochen Isotransplantat oder andere Gerüste mit einer mineralischen Komponente (insbesondere Calciumcarbonat) enthält, dass einige Verzerrungen bei der Segmentierung der Mikro-CT-Analyse eingeführt werden, da neu gebildeten Knochendichte teilweise überlappt mit entweder die Isotransplantat Dichte oder Gerüstdichte. Aus diesem Grund ist der Mikro-CT-Analyse der Knochenvolumen hauptsächlich das Volumen von mineralisiertem Gewebe (neugebildeten Knochen reflektieren erhalten sowieKnochenersatz) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten Rena Bizios für ihre wertvollen Kommentare über das Manuskript zu danken.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |