Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massive difetti ossei diafisarie sono una grande sfida per il chirurgo ortopedico. la sostituzione ossea con innesto osseo autologo, attualmente considerato come il trattamento gold-standard, è in quantità limitata ed è associata a morbidità raccolta legate. Per queste ragioni, costrutti osso tissutale, che conciliano cellule staminali mesenchimali del midollo osseo con ponteggi osteoconduttive sono stati esplorati come alternativa per autotrapianti in chirurgia ortopedica.
Fino ad oggi, la maggior parte degli studi sono stati condotti in modelli animali clinicamente rilevanti, quali cani, maiali e pecore 1-3, ma la valutazione preliminare di questi costrutti in ortotopico, segmentale, difetti ossei critico-size in modelli animali di piccola (come topi) potrebbe avere diversi vantaggi: (i) le spese basse, (ii) un gran numero di animali possono essere azionati; (Iii) in contrasto con grandi modelli animali, omogeneità dei ceppi di topi limita variazioni individuali scaffold riassorbimento unND formazione ossea e; (Iv) soprattutto, la disponibilità di anticorpi specifici e animali gene targeting consentono la valutazione del processo biologico coinvolto nella guarigione ossea. Ultimo ma non meno importante, l'uso di ceppi di topi immunodeficienti consente anche studi usando sia innesti o cellule di origine umana senza risposte immunitarie avverse nei topi.
Nonostante i vantaggi di cui sopra, enormi modelli difetto osseo diafisarie nei topi sono scarsi. La maggior parte di tali modelli utilizzano fissaggio osseo con un perno intramidollare che riempie la cavità del midollo osseo (limitando così il volume di materiale da testare) e ostacola anche la riproducibilità non fornendo rotazione ed assiale stabilità 2,4-7.
Gli obiettivi di questo studio sono: (i) simulando una situazione di non-union ossa clinica, per descrivere un riproducibili, critica-size, segmentale, modello di difetto femorale in topi, che è stabilizzata da accurate e riproducibili osteosynth bloccaggio a lamelleESIS che fornisce un ambiente biomeccanico altamente stabile 8-10; (Ii) illustrare il modello presente con due potenziali sostituti ossei e descrivere analisi formazione ossea che potrebbe essere utilizzato.
Impiantazione ectopica di materiali e dispositivi in topi ortopedici specifici è comunemente eseguita per valutare l'osso formando funzioni di vari ponteggi 13,14. tuttavia esistono importanti differenze tra i modelli ectopiche e ortotopico, compresi i fattori di segnalazione osteogenic nativi e le interazioni con le cellule paracrini che formano l'osso ospite.
Il presente studio stabilisce un riproducibile grande segmentale murino, critico-size difetti femorale (3,5 mm, circa il 20-25% della lunghezza del femore). Considerando le dimensioni di tale difetto e la stabilità fornita dalla osteosintesi piatto risultante, questo modello imita l'osso atrofica non-union clinicamente incontrato.
Il periodo di tempo post-operatorio scelto nel presente studio, è in linea con i topi modelli non sindacali precedentemente descritti, mostrando una mancanza di un'adeguata guarigione dopo 8 a 12 settimane 4,9,15,16.
Ancora più importante, reproducible e stabile osteosintesi, nonché stabilità dei sostituti ossei impiantati sono stati ottenuti senza morbilità e mortalità 1,2 con l'uso di entrambe piastra di bloccaggio e una maschera per eseguire l'osteotomia. Questo risultato contrasta anche i risultati riportati in cui sia un fissatore esterno o un chiodo endomidollare sono stati utilizzati 4,5,17-24. Per i fissatori esterni potenziali svantaggi includono: variabilità in rigidità, infezioni delle vie perni, allentando i perni, potenziali lesioni dovute ai perni e il peso dei materiali (da 4 a 20% del peso corporeo del mouse). Per il chiodo endomidollare potenziali svantaggi includono: riempimento della cavità midollare con il chiodo e danni iatrogeni delle superfici articolari.
Altri murino segmentale, critica size difetti femorali stabilizzate mediante piastra osteosintesi sono state descritte con difetto osseo creato da una fresa e da 1,5 a 2 mm di lunghezza 16,25. in the presente modello, l'uso di una maschera e un filo sega permesso una precisa osteotomia 3,5 millimetri a lungo senza muscoli significativi traumi.
Tuttavia, per riuscire a eseguire la procedura si dovrebbe prendere in considerazione alcuni punti chiave: non utilizzare piccolo topo (topi nudi o con un peso di meno di 25 grammi o di età inferiore a 8 settimane) altrimenti il piatto dovrebbe essere troppo lungo. Quando si avvicina l'osso femorale, fare attenzione a preservare sia il nervo sciatico caudalmente e la capsula articolare distale. Applicare la piastra sul lato anteriore dell'osso femorale e poiché l'allineamento della piastra è calcolato applicando questa prima vite, avere cura di posizionare la piastra parallela al femore durante l'inserimento questa prima vite.
Prima di effettuare il ostectomia, aver cura di effettuare una dissezione circolare del femore al centro della diafisi per evitare traumi muscolari. Quando si esegue l'osteotomia, l'assistente del chirurgo deve tenere saldamente la guida e il surgeon deve essere attento (i) non aggrovigliare il filo sega, (ii) utilizzare mezzo due terzi del filo durante l'applicazione di una tensione costante costante, e (iii) per evitare il movimento in eccesso per ottenere un taglio dritto osso.
guarigione ossea è possibile nella presente modello fornito un innesto osseo viene utilizzato. Inoltre, questo modello consente ulteriori studi dei meccanismi coinvolti nelle strategie di sostituzione delle ossa quando sia innesti o cellule umane di origine vengono utilizzati in un ben standardizzata grande, segmentale, difetti, osso.
Inoltre, in linea alle tendenze attuali che richiedono la raffinatezza e la riduzione di utilizzo di animali nella ricerca ortopedia legati, questo modello può essere utilizzato in combinazione con in vivo tecniche di imaging come la bioluminescenza. Tali tecniche non invasive permettono di monitorare sia la sopravvivenza delle cellule impiantate e la guarigione dei tessuti senza richiedere il sacrificio di animali 26.
Le principali limitazioni del presente modello sono sia lacondizioni portanti e il volume del difetto osseo creato perché non imitano completamente quelli incontrati clinicamente nell'uomo. Le limitazioni del modello sono (i) la radio-opacità del piatto che può richiedere la rimozione della piastra prima ex vivo μCT analisi e possono complicare l'interpretazione dei longitudinali risultati degli esami radiografici e, (ii) l'impossibilità di modulare piastra rigidezza può essere un parametro chiave meccanica nella formazione dell'osso 27-30.
Si deve tenere a mente anche, quando si utilizza isograft osso o altre impalcature che contengono una componente minerale (in particolare carbonato di calcio), che alcuni pregiudizi vengono introdotti nel processo di segmentazione delle analisi micro-CT, perché la densità ossea di nuova costituzione in parte sovrapposto con sia la densità isograft o densità patibolo. Per questo motivo il volume osseo ottenere dall'analisi micro-CT sono relativi principalmente il volume del tessuto mineralizzato (osso neoformato piùsostituto osseo) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Rena Bizios per i suoi preziosi commenti sul manoscritto.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |