Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massive diafysaire botdefecten zijn een grote uitdaging voor de orthopedisch chirurg. Botvervangingsmateriaal met autoloog bottransplantaat momenteel beschouwd als de gouden standaard behandeling is beperkt voorradig en wordt geassocieerd met oogsten morbiditeit. Daarom hebben tissue engineered bot constructen combineren beenmerg mesenchymale stamcellen met osteoconductief steigers onderzocht als alternatief voor autologe in orthopedische chirurgie.
Tot op heden zijn de meeste onderzoeken uitgevoerd bij klinisch relevante diermodellen zoals honden, varkens en schapen 1-3, maar voorlopige evaluatie van deze constructen in orthotope, segmentale, critical-size botdefecten in kleine diermodellen (zoals muizen) kan verschillende voordelen hebben: (i) lage kosten, (ii) grote aantallen dieren kunnen worden bediend; (Iii) in tegenstelling tot grote diermodellen, homogeniteit van de muizenstammen beperkt individuele variaties in een scaffold resorptiend botvorming en; (Iv) het belangrijkst, beschikbaarheid van specifieke antilichamen en van transgene dieren kan de evaluatie van de biologische processen betrokken bij botgenezing. Tot slot, gebruikt immunodeficiënte muizenstammen wordt tevens onderzoek met behulp van transplantaten of cellen van menselijke oorsprong zonder nadelige immuunreacties in muizen.
Ondanks de bovengenoemde voordelen, massieve diafysaire botdefect modellen in muizen zijn schaars. De meeste van dergelijke modellen gebruiken botfixatie met een intramedullaire pen die het beenmerg holte (dus de hoeveelheid materiaal beperkt te testen) vult en belemmert ook reproduceerbaarheid door niet de rotatie en axiale stabiliteit 2,4-7.
De doelstellingen van deze studie zijn (i) het nabootsen van een klinische been non-union situatie een reproduceerbare, kritische grootte segmentale femorale defect model in muizen, die wordt gestabiliseerd door nauwkeurige en reproduceerbare vergrendeling plaat osteosynth beschrijvenESIS dat een zeer stabiele biomechanische milieu 8-10 biedt; (Ii) de huidige model met twee potentiële botvervangers illustreren en te beschrijven botvorming analyses die kunnen worden gebruikt.
Buitenbaarmoederlijke implantatie van orthopedische-gerelateerde materialen en het apparaat in muizen wordt meestal uitgevoerd om de botvormende capaciteit van de verschillende steigers 13,14 beoordelen. Belangrijke verschillen echter tussen ectopische en orthotope modellen, waaronder native osteogene signalering factoren en paracriene interacties met gastheer-bot-vormende cellen.
De huidige studie stelt een reproduceerbare muizen een groot segmentaal, kritisch-size femorale defect (3,5 mm, ongeveer 20-25% van het dijbeen lengte). Gezien de omvang van een dergelijk gebrek en de stabiliteit die door de resulterende plaatosteosynthese, dit model bootst de klinisch-ondervonden atrofische bone non-union.
De gekozen in de huidige studie post-operatieve periode, is in lijn met de eerder beschreven non-union modellen muizen, met een gebrek aan adequate genezing na 8 tot 12 weken 4,9,15,16.
Belangrijker nog, gekopieerd sccible en stabiele osteosynthese, alsook stabiliteit van de geïmplanteerde botvervangers verkregen zonder aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit 1,2 met behulp van zowel borgschijf en een mal om het ostectomy voeren. Dit resultaat contrasteert ook de resultaten gerapporteerd wanneer ofwel een externe fixator of een mergnagel werden gebruikt 4,5,17-24. Voor de externe fixators potentiële nadelen zijn: variatie in stijfheid, infecties van de pennen stukken, los van de pennen, potentialen verwondingen als gevolg van de pennen en het gewicht van de materialen (4 tot 20% van de muis lichaamsgewicht). Voor de intramedullaire pen potentiële nadelen zijn: vullen van het medullaire holte met de nagel en iatrogene schade van de gewrichtsvlakken.
Andere muizen segmentale kritische grootte femorale defecten gestabiliseerd door plaatosteosynthese zijn beschreven botdefect door een braam en tussen 1,5 en 2 mm lengte 16,25. in the huidige model, het gebruik van een mal en een zaagkabel toegestaan precieze 3,5 mm lange ostectomy zonder noemenswaardige spieren trauma.
Echter, om te slagen in het uitvoeren van de procedure een rekening houdend met een aantal belangrijke punten moet nemen: Gebruik geen kleine muizen (Naakt muizen met ofwel een gewicht van minder dan 25 g of leeftijd jonger dan 8 weken) anders moet de plaat te lang. Bij het naderen van het dijbeen, zorg voor zowel de heupzenuw caudaal en het gewrichtskapsel distaal te behouden. Breng de plaat op de voorste zijde van het dijbeen en omdat de aanpassing van de plaat wordt bepaald door toepassing van de eerste schroef, zorg om de plaat parallel te positioneren om het dijbeen bij het plaatsen van de eerste schroef.
Alvorens de ostectomy, zorg om een ronde dissectie van het dijbeen optreden op het midden van de diafyse te gespierde trauma te voorkomen. Bij het uitvoeren van de ostectomy, moet de assistent van de chirurg stevig vast te houden van de gids en de surGeon moet voorzichtig (i) de zaagkabel niet klitten zijn, (ii) de middelste twee derde van de draad gebruiken terwijl het aanbrengen van een constante constante spanning, en (iii) om overtollig beweging voorkomen dat een rechte snede bot te verkrijgen.
Botgenezing kan in het onderhavige model van een bottransplantaat wordt gebruikt. Bovendien is dit model maakt verdere studies van het bij vervanging van bot strategieën mechanismen als humaan-oorsprong transplantaten of cellen worden gebruikt in een goed-gestandaardiseerd, grote segmentaal, botdefect.
Bovendien, overeenkomstig de huidige trends die verfijning en vermindering van het gebruik van dieren in orthopedie gerelateerd onderzoek, kan dit model worden gebruikt in combinatie met in vivo beeldvorming technieken zoals bioluminescentie. Dergelijke niet-invasieve technieken maken het mogelijk het toezicht op beide geïmplanteerd overleving van cellen en weefsel genezing zonder dat het offeren van dieren 26.
Belangrijke beperkingen van het huidige model zijn zowel dedragende geeft de omvang van het botdefect gemaakt omdat zij niet volledig nabootsen klinisch bereikte bij mensen. Andere beperkingen van het model (i) de radio-opaciteit van de plaat, die verwijdering van de plaat nodig voor ex vivo μCT analyse en de vertolking van de longitudinale radiografisch onderzoek resultaten compliceren, (ii) het onvermogen om plaat stijfheid moduleren die kan een belangrijke mechanische parameter in botvorming 27-30 zijn.
Men moet in gedachten houden ook bij gebruik van zowel bot isotransplantaat of andere draagstructuren die een minerale component (in het bijzonder calciumcarbonaat), dat een lichte voorkeur worden in het segmentatieproces van de micro-CT analyse, omdat nieuw gevormde botdichtheid gedeeltelijk overlappen ofwel de isotransplantaat dichtheid of steiger dichtheid. Om deze reden is het bot volume krijgen door de micro-CT analyse vooral de omvang van deze gemineraliseerde weefsel (nieuw gevormde bot plusbotvervanger) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Rena Bizios bedanken voor haar waardevolle commentaar op het manuscript.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |