Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
大規模な骨幹骨欠損は、整形外科医にとって大きな挑戦です。現在、ゴールド標準治療として考慮自家骨移植と骨の交換は、限られた供給であり、収穫関連の罹患率と関連しています。これらの理由から、骨伝導足場と骨髄間葉系幹細胞を結合組織工学骨の構築物は、整形外科手術における自家移植のための代替として検討されています。
以下のような(これまでに、研究のほとんどは、イヌ、ブタやヒツジ1-3のような臨床的に関連する動物モデルで行われているが、小動物モデルにおいて同所、分節、重要なサイズの骨欠損におけるこれらの構築物の予備的評価マウス)は、いくつかの利点を有することができる:(I)低コスト、(ii)は、動物の多数を操作することができます。 (iii)の大型動物モデルとは対照的に、マウス系統の均一性は、足場吸収Aの個々の変動を制限しますND骨形成と、 (iv)の最も重要なのは、特異的抗体および遺伝子標的動物の可用性は、骨の治癒に関与する生物学的プロセスの評価を可能にします。最後になりましたが、マウスの免疫不全株の使用はまた、マウスにおいて有害な免疫応答せずにグラフトまたはヒト由来の細胞のいずれかを用いた研究を可能にします。
上記の利点にもかかわらず、マウスでの大規模な骨幹骨欠損モデルは疎です。このようなモデルの大部分は(従って、試験される材料の量を制限する)骨髄腔を満たす髄内ピンが骨固定を使用しても、回転と軸方向の安定性2,4-7を提供しないことにより、再現性を妨げます。
現在の研究の目的は、(i)正確で再現性のロッキングプレートosteosynthによって安定化され、再現性、重要なサイズ、分節、マウスでの大腿骨欠陥モデルを記述するために、臨床骨癒合の状況を模倣しています安定性の高い生体力学的環境8-10を提供ESIS。 (II)は、2つの潜在的な代用骨を有する本モデルを説明するために骨形成がそれを使用することができる分析について説明します。
マウスにおける整形外科関連材料及びデバイスの異所性移植は、一般に、様々な足場13,14の容量が骨形成を評価するために行われます。重要な違いは、しかし、ネイティブの骨形成のシグナル伝達因子およびホスト骨形成細胞とのパラクリン相互作用を含む異所性および同所性モデル、間に存在します。
本研究は、再現性のネズミ大きなセグメントを確立し、重要なサイズの大腿骨欠陥(3.5ミリメートル、大腿骨の長さの20〜25%)。このような欠陥の大きさや、得られたプレート骨接合により提供される安定性を考慮すると、このモデルは、臨床的に遭遇萎縮性骨非組合を模倣します。
本研究で選択した術後の期間、8〜12週間4,9,15,16の後、充分な治癒の欠如を示す、先に述べた非組合モデルマウスに沿ったものです。
最も重要なのは、reproducibleと安定した骨接合術だけでなく、移植骨代替物の安定性は、ロッキングプレートと骨切除を実行するための治具の両方を使用してかなりの罹患率と死亡率1,2せずに得られました。この結果はまた、創外固定器または髄内釘のいずれかを4,5,17-24使用されたときに報告された結果を対比しています。創外固定器のための潜在的な短所は次のとおりです。剛性の変動、ピントラクトの感染症、ピンの緩みは、ピンと材料の重量(マウスの体重の4〜20%)に起因する負傷を電位。髄内釘のための潜在的な短所は次のとおりです。ネイルや関節面の医原性損傷と骨髄腔の充填を。
他のネズミ分節、プレート骨接合することによって安定化の重要なサイズの大腿骨欠陥がバリで作成された骨欠損して説明し、1.5〜2 mmの長さ16,25に至るまでされています。目でE現在のモデル、治具やソーワイヤーの使用はかなりの筋肉の外傷のない正確な3.5ミリメートル長骨切除を可能にしました。
しかし、一つは考慮いくつかの重要なポイントを取るべき手順を実行するのに成功します(8週間の下で25グラムまたは歳未満の体重のいずれかでのヌードマウス)小さなマウスを使用しないでくださいそれ以外の板が長すぎるすべきです。大腿骨に接近すると、遠位尾側坐骨神経や関節包の両方を維持するために注意してください。大腿骨の前方側のプレートを適用し、プレートの位置合わせは、この第1のねじの用途によって決定されているので、この第1のねじを挿入する際に大腿骨にプレートを平行に配置するために注意してください。
骨切除を行う前に、筋肉の外傷を避けるために骨幹の中央に大腿骨の円形切開を行うように注意してください。骨切除を行う場合には、外科医のアシスタントがしっかりとガイドとシュールを保持する必要がありますGEONは、一定の安定したテンションをかけながら(ii)の線の真ん中の三分の二を使用すること、および(iii)ストレート骨カットを得るために、過剰な動きを避けるために、(ⅰ)ソーワイヤーをもつれないように注意する必要があります。
本モデルは、骨移植片が使用されて設けられた骨の治癒が可能です。また、このモデルは、ヒト由来の移植片または細胞のいずれかは、よく標準化され、大規模な、分節、骨欠損で使用されている骨代替戦略に関与するメカニズムのさらなる研究を可能にします。
また、改良及び整形外科関連研究における動物の使用の減少を必要とする現在の傾向に沿って、このモデルは、生物発光などのインビボイメージング技術と組み合わせて使用することができます。このような非侵襲性の技術は、動物の犠牲26を必要とせずに両方の移植細胞の生存および組織の治癒を監視可能にします。
現在のモデルの主な制限は両方とも耐荷重条件、彼らは完全にヒトでの臨床的に遭遇するものを模倣していないため、作成した骨欠損のボリューム。モデルの他の制限は、(i)ex vivoで μCT分析の前にプレートの除去を必要とする場合があり、縦方向の放射線検査結果の解釈を複雑にする可能性があるプレートの放射線不透過性とは、(ii)はできないことは、プレートの剛性を調節するためにしています骨形成27-30における主要な機械的パラメータであってもよいです。
骨同系移植片、または(特に炭酸カルシウム)のミネラル成分を含む他の足場のいずれかを使用した場合、新たに形成された骨密度は、部分的に重なっているため一つは、いくつかのバイアスがマイクロCT解析のセグメンテーションプロセスに導入されていること、また、心に留めておく必要があります同系移植片の密度や足場の密度のいずれか。骨体積は、マイクロCT解析によって得られる。このような理由から、主に石灰化した組織(新しく形成された骨の量を反映プラス代用骨)11,26,31。
The authors have nothing to disclose.
著者は、原稿の彼女の貴重なコメントをレナBiziosに感謝したいです。
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |