Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

Т-лимфоциты являются важнейшими компонентами адаптивной иммунной системы. Т-клетки ответственны за не только непосредственно опосредовании защитные иммунные ответы к патогенам с помощью различных эффекторных механизмов, но и активно поддерживать иммунологическую аутотолерантность и направляя ответы других клеток в иммунной системе. Эти функции направлены через ряд интегрированных сигналов, в том числе Т-клеточного рецептора (TCR) лигирования, цитокинов и хемокинов, и метаболитов ^1. Из этих сигналов, TCR имеет особое значение, так как она обеспечивает характерную специфичность, которая определяет роль Т-клеток в адаптивного иммунитета. TCR взаимодействует с линейными пептидных антигенов, представленных MHC (человек ортолог HLA) молекул (ПКИКЖ комплексов) в специфической и чувствительной манере, чтобы обеспечить сигналы, которые инициируют функцию клеток эффекторных Т. Биохимические параметры TCR взаимодействия с ПКИКЖ лигандов обеспечить не только специфику для Tклеточной активации, но также имеют качественную воздействие на последующее функции Т-клеток ^2. Таким образом, изучение функции Т-клеток часто требуется рассмотрении ответов на клоновых Т-клеток с определенной антигенной специфичности.

Человек Т-клеток отсек, содержащий приблизительно 10 ¹² αβ Т-клеток, содержит примерно 10 ⁷ – 10 ⁸ различных αβTCRs ^3-4. Это Разнообразный репертуар предоставляет возможность для признания огромного массива пептидов из потенциальных патогенов, что бы потребовать ответа Т-клеток для защитного иммунитета. Подсчитано, что частота Т-клеток в ответ на заданном чужеродного антигена, представленного себя MHC составляет порядка 10 ^-4 – 10 ^-7 при отсутствии предварительного иммунного ответа на этот антиген ^5. Наивный Т-клеток репертуар формируется тимуса отбора, чтобы обеспечить способность распознавать собственного MHC представляя пептидные антигены и ограничения реагироватьivity против самостоятельных пептид антигенов, максимизации потенциальной полезности для посреднических защитный иммунитет ^2. Тем не менее, в нарушение этого разработана реактивность, относительно большой частоты, 10 ^-3 – 10 ^-4, Т-клеток от иммунологически наивных лиц реагировать на стимуляцию с аллогенных клеток, признавая обе иностранные молекулы МНС, а также эндогенные пептиды они представляют ^6. Признание аллогенных лигандов ПКИКЖ структурно похож на признании иностранных антигенов, представленных самостоятельной МНС; TCR имеет критические биохимические взаимодействия как с аллогенной молекулы МНС, а также представленного пептидом ^7. Прочный характер ответа Т-клеток к аллогенных результатов стимуляции из разнообразия рМНС комплексы, присутствующие на поверхности аллогенных клеток ^8. Подсчитано, что каждый представляет МНС примерно 2 х 10 ⁴ различные эндогенные пептидные антигены ^9. Это бreadth реакции на аллогенной стимуляции является существенным аспектом клинически соответствующей патологии, такие как отторжение аллотрансплантата или трансплантат против хозяина (РТПХ), в результате Т-клеток аллореактивность.

Изучение человека Т-клеток аллореактивными ответов традиционно полагались на рассмотрении поликлональные ответы наивных Т-клеток после стимуляции аллогенных клеток. Повторные стимуляции с одной и той же линии аллогенных клеток в сочетании с ограниченным разбавлением анализ способен генерировать клоновых Т-клеток с определенной признания аллогенной HLA ^10. Тем не менее, этот подход является проблематичным для изучения ответов на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ, как большой и разнообразный репертуар эндогенного рМНС комплексы присутствует при заданном аллогенных HLA стимулирует широкий репертуар Т-клеток. Это возбуждение масса населения и ограничение подход потребует разбавления скрининг большого числа клонов, чтобы изолировать Т-клеток с желаемым реакционномVity против одного ПКИКЖ лиганда. Кроме того, частота Т-клеток, отвечающих на индивидуальной аллогенной ПКИКЖ лиганда является относительно низким среди наивных Т-клеточных популяций, который представляет собой барьер для эффективной генерации клонов Т-клеток человека, реагирующих на данному антигену.

Выявление и изоляция антиген-специфических Т-клеток из поликлональных популяций были включены по развитию флуорофорных меченных ПКИКЖ мультимерами ^11. Этот подход использует определенные пептидные антигены загруженные в рекомбинантных растворимых биотинилированных молекул МНС, которые помечены путем связывания с стрептавидин-меченого флуорофора. Мультимеризации рМНС увеличивает алчность, компенсируя неразрывно низкий (мкм) сродства TCR для растворимых лигандов ПКИКЖ. Меченые клетки могут быть идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, этот подход все еще ограничено низкой частоты антиген-специфических Т-клеток среди населения наивных Т-клеток, которые, как правило,порядков меньше, чем предел точной идентификации и количественного определения на большинстве цитометров. Для решения этой ограничение, метод ПКИКЖ тетрамера маркировки и последующего обогащения магнитного бисера для тетрамерных-меченых клеток были разработаны ^12. Этот метод показал, надежное обнаружение, перечисление, и выделение низкочастотных антиген-специфических Т-клеток.

Этот протокол описывает эффективный протокол для генерации клонов Т-клеток человека, которые специфически реагируют на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ. Протокол применяется ПКИКЖ (HLA) мультимера маркировки и обогащение для выделения Аллоантиген-специфический Т-клеток человека с проточной цитометрии сортировки клеток и надежный метод для культуры в пробирке человеческих Т-клеток, чтобы обеспечить выпуск клонов Т-клеток из отдельных отсортированных клеток ( Обзор на рисунке 1).