Summary

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Published: November 21, 2014
doi:

Summary

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Abstract

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Introduction

T-lymfocyten zijn kritische componenten van het adaptieve immuunsysteem. T-cellen zijn verantwoordelijk voor niet alleen direct bemiddelen beschermende immuunresponsen tegen pathogenen via verschillende effector mechanismen, maar ook actief handhaven immunologische zelftolerantie en richten van de reacties van andere cellen in het immuunsysteem. Deze functies worden doorheen een aantal geïntegreerde signalen, waaronder T-cel receptor (TCR) ligatie, cytokines en chemokines en metabolieten 1. Van deze signalen, het TCR is van bijzonder belang, omdat de kenmerkende specificiteit die rol van de T cel definieert adaptieve immuniteit. Een TCR interactie met lineaire peptide antigenen door MHC (HLA humane ortholoog) moleculen (pMHC complexen) dat in een zeer specifieke en gevoelige wijze de signalen die T cel effectorfunctie initiëren. De biochemische parameters van TCR interactie met pMHC liganden niet alleen de specificiteit voor Tcel activatie, maar ook een kwalitatieve invloed op daaropvolgende T-celfunctie 2. Aldus bestuderen T-celfunctie vereist vaak behandeling de reacties van klonale T-cellen met gedefinieerde antigene specificiteit.

De humane T-cel compartiment, die ongeveer 10 12 αβ T-cellen bevat naar schatting 10 juli 10 augustus afzonderlijke αβTCRs 3-4. Dit divers repertoire biedt gelegenheid voor de erkenning van de enorme serie van peptiden uit potentiële ziekteverwekkers die een T-cel respons voor beschermende immuniteit zouden vereisen. Geschat wordt dat de frequentie van T-cellen reageren op een bepaald vreemd antigeen door zelf-MHC in de orde van 10 -4 – 10 -7 bij ontstentenis van voorafgaande immuunrespons tegen dat antigeen 5. De naïeve T-cel repertoire wordt gevormd door thymus selectie die zichzelf herkennen MHC-peptide-antigenen presenteren en beperken reageren verzekerentiviteit tegen zelf-peptide-antigenen, het maximaliseren van het potentieel nut voor het bemiddelen van beschermende immuniteit 2. In strijd met deze ontworpen reactiviteit, een relatief grote frequentie, 10 -3 – 10 -4, van T-cellen uit immunologisch naïeve individuen reageren op stimulatie met allogene cellen, en zowel het vreemde MHC-moleculen en de endogene peptiden zij opleveren 6. De erkenning van allogene pMHC liganden is structureel vergelijkbaar met de erkenning van buitenlandse antigenen gepresenteerd door zelf-MHC; de TCR maakt kritische biochemische interacties met zowel allogene MHC-molecuul en het gepresenteerde peptide 7. De robuuste karakter van de respons van T-cellen allogene stimulatie gevolg van de diversiteit van pMHC complexen aanwezig op het oppervlak van allogene cellen 8. Geschat wordt dat elk MHC geeft ongeveer 2 x 10 4 verschillende endogene peptide antigenen 9. Deze breadth respons op allogene stimulatie is een belangrijk aspect van de klinisch relevante pathologie, zoals transplantaatafstoting of graft versus host disease (GVHD) als gevolg van T cel alloreactiviteit.

Studie van humane T cel responsen alloreactieve traditioneel vertrouwd op behandeling polyklonale responsen van naïeve T-cellen na stimulatie met allogene cellen. Herhaalde stimulatie met dezelfde allogene cellijn gecombineerd met beperkende verdunning analyses kan genereren klonale T-cellen met gedefinieerde erkenning van allogene HLA 10. Deze benadering is problematisch voor de behandeling reacties op individuele allogene pMHC liganden, zoals de grote en diverse repertoire van endogene pMHC complexen voor een bepaalde allogene HLA onderhavige stimuleert een breed repertoire van T-cellen. Deze massapopulatie stimulatie en beperkende verdunning aanpak screening van grote aantallen klonen vereisen om T-cellen te isoleren met de gewenste Reactivity tegen een enkele pMHC ligand. Bovendien is de frequentie van T-cellen reageren op een individuele allogene pMHC ligand relatief laag bij naïeve T-cel populaties die een belemmering voor efficiënte productie van humane T cel klonen die reageren op een bepaald antigeen presenteert.

Identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen van polyklonale populaties zijn ingeschakeld door de ontwikkeling van fluorofoor gelabeld pMHC multimeren 11. Deze benadering maakt gebruik van specifiek peptide antigenen in recombinante oplosbare gebiotinyleerde MHC moleculen die gelabeld door binding aan een met streptavidine gemerkt fluorofoor geladen. Multimerizatie van pMHC verhoogt de gretigheid, het compenseren van de intrinsiek lage (uM) affiniteit van TCR voor oplosbare pMHC liganden. Gelabelde cellen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd door flowcytometrie. Echter, deze benadering nog steeds beperkt door de lage frequentie van antigeen-specifieke T-cellen bij naïeve T-celpopulaties, die typischordes van grootte kleiner dan de limiet van nauwkeurige identificatie en kwantificatie van de meeste flowcytometers. Om deze beperking te pakken, is een werkwijze pMHC tetrameer labeling en daaropvolgende magnetische bead verrijking voor tetrameer gelabelde cellen 12 ontwikkeld. Deze methode betrouwbare detectie, telling en isolatie van laagfrequente antigeen-specifieke T-cellen aangetoond.

Dit protocol beschrijft een effectief protocol voor het genereren van humane T cel klonen die specifiek reageren op afzonderlijke allogene pMHC liganden. Het protocol geldt pMHC (HLA) multimeer etikettering en verrijking voor de isolatie van allogeen-specifieke menselijke T-cellen met flowcytometrie celsortering en een robuuste werkwijze voor in vitro kweek van humane T-cellen om de productie van T-celklonen uit één gesorteerde cellen (inschakelen overzicht in figuur 1).

Protocol

OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van perifere bloedmonsters van menselijke vrijwilligers. Al het onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden beoordeeld en goedgekeurd door een Human Studies Institutional Review Board goedgekeurd om de naleving van de Verklaring van Helsinki (2013) en het Health Insurance Portability en Accountability Act van 1996 te verzekeren. 1. Isolatie van T-cellen uit volbloed Voorafgaand aan het starten, warm de dichtheidsgradiënt medium t…

Representative Results

Dit protocol beschrijft de productie van klonale menselijke T celculturen met gedefinieerde specificiteit allogeen via een magnetische kraal verrijking en eencellige flowcytometrie sortering strategie. Figuur 1 geeft een overzicht van het proces. Figuur 1: Protocol overzicht Het protocol beschreven hier biedt een betrouwbare methode voor het g…

Discussion

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100 x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

Referências

  1. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
  2. Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
  3. Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
  4. Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
  5. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
  6. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  7. Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
  8. Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
  9. Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
  10. Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
  11. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  12. Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  13. Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
  14. Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
  15. Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
  16. Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
  17. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

View Video