توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
الخلايا اللمفية تي هي مكونات أساسية في الجهاز المناعي التكيفي. خلايا T هي المسئولة عن ليس فقط التوسط مباشرة استجابات مناعية وقائية لمسببات الأمراض من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المستجيب، ولكن أيضا الحفاظ بنشاط التسامح المناعي الذاتي وتوجيه استجابات خلايا أخرى في جهاز المناعة. يتم توجيه هذه الوظائف من خلال عدد من الإشارات متكاملة، بما في ذلك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ربط، والسيتوكينات كيموكينات، والأيض 1. من هذه الإشارات، وTCR له أهمية خاصة، حيث أنه يوفر خصوصية المميزة التي تحدد دور الخلايا التائية في المناعة التكيفية. يتفاعل مع مستضدات TCR الببتيد الخطية التي قدمها MHC (HLA ortholog البشري) جزيئات (المجمعات PMHC) بطريقة محددة جدا وحساسة لتوفير الإشارات التي تبدأ T وظيفة الخلايا المستجيب. المعلمات البيوكيميائية من التفاعلات مع TCR بروابط رهن العقاري توفر ليس فقط خصوصية لTتنشيط الخلايا، ولكن أيضا أن يكون لها تأثير نوعي على وظيفة خلايا T لاحقا 2. وبالتالي، دراسة وظيفة خلايا T وغالبا ما يتطلب دراسة استجابات الخلايا التائية نسيلي مع خصوصية محددة المستضدات.
تي المقصورة الخلية البشرية، التي تحتوي على ما يقرب من 10 12 خلايا T αβ، ويحتوي على ما يقدر بنحو 10 يوليو – 10 أغسطس αβTCRs متميزة 3-4. يوفر هذا ذخيرة متنوعة فرصة للاعتراف مجموعة واسعة من الببتيدات من مسببات الأمراض المحتملة التي من شأنها أن تتطلب استجابة خلايا T للمناعة وقائية. وتشير التقديرات إلى أن وتيرة خلايا تي الاستجابة لمستضد الأجانب نظرا قدمها MHC الذاتي هو بناء على أمر من 10 -4 – 10 -7 في غياب الاستجابة المناعية قبل أن مستضد 5. يتشكل من السذاجة الخلايا التائية ذخيرة عن طريق الانتقاء الغدة الصعترية لضمان القدرة على التعرف على الذات MHC تقديم المستضدات الببتيد والحد تتفاعلivity ضد المستضدات الببتيد الذاتي، وتعظيم الفائدة المحتملة للوساطة مناعة وقائية 2. ومع ذلك، في انتهاك لهذا التفاعل تصميم، تردد كبير نسبيا، 10 -3 – 10 -4، خلايا تي من الأفراد ساذج مناعيا الرد على التحفيز مع خلايا الاعضاء المختلفة وراثيا، والاعتراف كلا من جزيئات MHC الأجنبية وكذلك الببتيدات الذاتية ما يقدمونه 6. الاعتراف بروابط PMHC خيفي يشبه هيكليا إلى الاعتراف مستضدات أجنبية قدمها MHC على الذات؛ وTCR يجعل التفاعلات الكيميائية الحيوية الهامة مع كل من الجزيء MHC خيفي فضلا عن تقديمها 7 الببتيد. مجمعات الطبيعة القوية لاستجابة خلايا T إلى نتائج التحفيز خيفي من تنوع PMHC موجودة على سطح الخلايا خيفي 8. ويقدر أن كل MHC يقدم حوالي 2 × 10 4 مختلف المستضدات الذاتية الببتيد 9. هذا بreadth الاستجابة للتحفيز خيفي هو جانب هام من أمراض سريريا ذات الصلة، مثل رفض المزروع أو الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف (GVHD)، الناتجة عن الخلايا التائية alloreactivity.
دراسة استجابات الخلايا التائية alloreactive الإنسان قد اعتمدت تقليديا على دراسة الردود بولكلونل خلايا T ساذجة التالية التحفيز مع خلايا خيفي. التحفيز المتكرر مع نفس خط الخلية خيفي جنبا إلى جنب مع الحد من التخفيف يحلل قادر على توليد خلايا T نسيلي مع الاعتراف محددة من خيفي HLA 10. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مشكلة لدراسة الردود على الفرد بروابط PMHC خيفي، ومرجع كبير ومتنوع من الذاتية PMHC مجمعات الحالي لخيفي نظرا HLA يحفز ذخيرة واسعة من خلايا تي. وهذا من شأنه تحفيز السكان السائبة والحد من نهج التخفيف تتطلب فحص أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة لعزل خلايا T مع reacti المطلوبvity ضد PMHC يجند احد. بالإضافة إلى ذلك، تردد خلايا تي الاستجابة لفرد خيفي PMHC يجند منخفض نسبيا بين السكان السذاجة الخلايا التائية، مما يشكل عائقا أمام جيل فعال من استنساخ الخلايا التائية البشرية تستجيب لمستضد معين.
وقد مكن تحديد وعزل خلايا T مستضد معين من السكان بولكلونل من خلال تطوير المسمى fluorophore PMHC multimers 11. هذا النهج يستخدم المضادات الببتيد محددة تحميلها في المؤتلف للذوبان جزيئات MHC المعقدة البيروكسيديز، والتي وصفت من قبل الملزم إلى fluorophore المسمى streptavidin. Multimerization للرهن العقاري يزيد من الطمع، وتعويض عن انخفاض جوهري (ميكرومتر) تقارب من TCR للرهن العقاري بروابط القابلة للذوبان. ويمكن تحديد وعزل الخلايا المسمى من قبل التدفق الخلوي. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا تزال محدودة بسبب التردد المنخفض من خلايا تي مستضد معين بين السكان السذاجة الخلايا التائية، والتي عادة ما تكونأوامر من حجم أقل من الحد من تحديد دقيق وتقدير على معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي. لمعالجة هذا القيد، تم تطوير طريقة للرهن العقاري ووضع العلامات tetramer احق تخصيب حبة المغناطيسي للخلايا المسمى tetramer 12. وقد أثبتت هذه الطريقة الكشف موثوق بها، تعداد، وعزل خلايا T مستضد معين التردد المنخفض.
يصف هذا البروتوكول بروتوكول فعال لتوليد استنساخ الإنسان خلايا T التي تستجيب خصيصا لالفردية بروابط PMHC خيفي. ينطبق البروتوكول رهن العقاري (HLA) متعدد القسيمات وضع العلامات وإثراء لعزل خلايا T الإنسان مستضد خيفي خاصة مع التدفق الخلوي خلية الفرز وسيلة قوية للثقافة في المختبر من خلايا T البشرية لتمكين إنتاج تي استنساخ خلية من خلايا مرتبة واحدة ( نظرة عامة في الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
Referências
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
