Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Protein-protein etkileşimleri, birçok biyolojik sürecin önemli olan ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) gibi etiket içermeyen optik yöntemler ¹ bağlanması ve ayrışma kinetikleri incelemek için in vitro olarak kullanılmıştır. Çoğu etiket içermeyen yöntemleri, sensor yüzeyi üzerine hareketsiz bir biyomolekülün ve hareketsizleştirilmiş biyomolekülün ¹ ile ilişkilendiren olarak çözeltiden bir bağlanma partneri tespit etmek için bir optik sinyal kullanır. SPR, son derece hassas bir yöntem olmasına rağmen, bunun nedeni sensörün ² üzerinde akan solüsyonun kırılma endeksi değişikliklere girişime maruz kalır. SPR, Bio-katmanlı interferometrisi (BLI) gibi duyarlı değil az numune bileşiminde ^1,3 değişikliklerden etkilenir rağmen. BLI ucunda özel bir biyouyumlu kaplamaya sahip fiber optik biyohissedicilerin kullanır. (Sekizli-RED96) Burada kullanılan sistemi sekiz spektrofotmetrelere içerir. Beyaz ışık bir robot kol hareket prob bir satıra taşınıyor. Fiber optik sensörler are problar tarafından yakalandı ve numuneleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plakaya taşınır. Hedef moleküllerin bir biyoalgılayıcı yüzey üzerinde immobilize edilir. Daha sonra sensör çözelti içinde bağlanma ortağı ihtiva eden oyuklara taşınır. BLI hareketsizleştirilmiş molekül ile bağlanma partnerinin ilişki izler ve daha sonra bağlanma partneri olmadan çözeltisine hareket sensörleri sonra ayrışma izler. Biyosensör yüzeyine moleküllerin bağlayıcı bir iç yüzeyinden ve sensör ve çözüm arasındaki dış arayüzünden geri Spektrofotometrelerin yansımadı ışık dalgaları arasındaki optik girişime değişikliklere yol açar. Girişim bu değişiklikler, miktarı ve Şekil 1 'deki animasyon özetlendiği gibi, bağlayıcı ve ayrışma kinetik oranlarını belirlemek için kullanılabilir.

Biz katalitik bakteriyel ATP sentaz kompleksi ve enzim oto-inhibe olabilir onun ε alt birimi arasındaki etkileşimleri ölçmek için BLI uyguladık. ATP synthase sentezi ve ATP ⁴ hidrolizini katalize eden bir zara gömülü döner nanomotor olduğunu. Katalitik kompleksi (F _1), bir ATPaz olarak çalışan bir çözünür bir biçimde izole edilebilir. Alt-birim ε iki etki var N-terminal alanı (NTD) doğru montaj ve enzimin işlevsel bağlanması için gerekli olan ancak katalitik alt birimleri ile doğrudan etkileşim değildir, C-terminal sahası (CTD) ile etkileşerek enzimi inhibe Birden fazla alt birimler katalitik ^5,6. Bu, ε-aracılı düzenleme bakteri ATP sentaz özgüdür ve mitokondriyal homologunun gözlenmemektedir. Ilaca dirençli tüberküloz ⁷ tedavisinde bedaquiline son zamanlarda FDA onayı ile gösterildiği gibi, ATP sintaz, antibakteriyel ilaçlar için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Böylece, ilaç keşfi için ε inhibitör rolünü hedef mitokondriyal ATP sentezini inhibe yok antibakteriellerle verim verebilecek. İzole edilmiş katalitik kompleksi (F _1), ile, εçözünmeyen bir alt birim olur. Bununla birlikte, F ₁ bağlanmıştır ε ile εCTD kısmen enzimin orta boşluk içine sokulması ve doğrudan doğruya ^6,8 ayırmak mümkün olan önleyici durumunu oluşturan, dramatik bir konformasyonel değişikliği tabi olabilir. Biz katalitik site ε en konformasyonuna ligandları allosterik etkilerini incelemek için, dolaylı olarak F ₁ / ε bağlanma ve ayrışma kinetiği ölçmek ve BLI kullanın.

Sistemimizde, ε (SPR) gibi BLI sinyal yana algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirmek için seçildi yüzeyinde bağlayıcı moleküllerin kütlesinin duyarlıdır. Ε alt birim ana F ₁ kompleksi (~ 347 kDa), küçük (~ 15 kDa) görecelidir. Bu nedenle, daha büyük bir BLI sinyal hareketsizleştirilmiş ε, F ₁ bağlanmasını ortaya çıkar. Çok yavaş olabilir F ₁ ayrışma, izleme amacıyla, ε güçlü hareketsiz olması gerekir. Böylece biotinylate seçtiVe streptavidin kaplı biyosensör üzerinde hareketsiz. Proteinler yüzey lisin ⁹ (i) rastgele modifikasyon, bir biotin-maleimid maddesi ¹⁰ ya da (iii) genetik olarak enzimatik sırasında biyotinile belirli bir biotin-peptidi alıcı ekleme ile eşsiz bir yerel veya tasarlanmış sistein (ii) reaksiyonu ile biyotinile edilebilir etiketli proteinin ¹¹ in vivo ifadesi. Sistemimizde, ε yöntem (iii) ⁸ kullanılarak biyotinile edilir. Biotin-etiketli streptavidin ε sensör üzerinde immobilize olduğu zaman, BLI bağlanması ve alt-birimi ε (F ₁ (ε-)) içinde tükendiği F ₁ ayrışımı ölçebilen. Burada tarif edilen deneyler için, ön deneyler sensörleri hareketsiz hale getirmek için biotinlenmiş proteinin uygun miktarlarının tespiti için yapılmıştı. Bu, proteinin molekül ağırlığı ve bağlanma partneri üzerinde bağlı olarak değişebilir, ancak hedef hareketsiz protein t az miktarda tespit etmektirhat içerir (i) olarak uygun bir sinyal-gürültü a (K _D aşağıda) bağlanma partnerinin düşük konsantrasyonu ve bağlanma partnerinin yakın doyurulması konsantrasyonu ile kinetik bağlanmasının (ii) en az bozulmayla kinetik bağlanma için. Ayrıca, biyotinilasyon stokiyometrisi tutarlı BLI sinyali streptavidin kaplı üzerinde hareketsizleştirilmesi sırasında elde edilebileceğini teyit etmek için değişebilir (ancak> 1 biyotin mol / mol protein önlemek), bu deney, bir ilk biyotinile edilmiş proteinin her yeni yeri için gerekli olabilir sensörler.