Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation ¹ studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül ¹ zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor ² fließt. Obwohl nicht so empfindlich wie SPR, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) weniger von Änderungen in der Probenzusammensetzung ^1,3 betroffen. BLI verwendet LWL-Biosensoren, die eine proprietäre biokompatible Beschichtung an der Spitze zu haben. Das hier verwendete (Octet-RED96)-System enthält acht Spektralphotometer. Weißes Licht wird an einer Reihe von Sonden, die an einem Roboterarm bewegen geleitet. Faseroptische Sensoren are, aufgenommen durch die Sonden und in eine Platte mit 96 Vertiefungen enthaltenden Proben. Eines der Zielmoleküle auf der Biosensoroberfläche immobilisiert. Dann Sensoren werden in die Vertiefungen, die die Bindungspartner in der Lösung bewegt wird. BLI überwacht Verband der Bindungspartner immobilisiert mit dem Molekül und überwacht Dissoziation nach dem Umzug die Sensoren an-Lösung ohne den Bindungspartner dann. Bindung von Molekülen an die Biosensor-Oberfläche führt zu Änderungen der optischen Interferenz zwischen Lichtwellen, die von einer Innenfläche und von der externen Schnittstelle zwischen Sensor und zurück in die Lösung Spektralphotometer reflektieren. Diese Veränderungen in der Interferenz quantifiziert und zur kinetischen Raten der Bindung und Dissoziation, wie in der Animation der Figur 1 zusammengefaßt bestimmen.

Wir haben BLI angelegt, um Wechselwirkungen zwischen dem katalytischen Komplex von bakteriellen ATP-Synthase und seine ε-Untereinheit, die das automatische hemmen das Enzym zu messen. ATP synthase ist eine membranständige Drehnanomotor, der Synthese und Hydrolyse von ATP katalysiert ^4. Der katalytische Komplex (F ₁₎ in einer löslichen Form, die als ATPase arbeitet isoliert werden. Ε-Untereinheit besitzt zwei Domänen: die N-terminale Domäne (NTD) ist die korrekte Montage und funktionelle Kopplung des Enzyms notwendige, aber nicht direkt interagieren mit den katalytischen Untereinheiten, der C-terminalen Domäne (CTD) kann das Enzym durch die Interaktion mit inhibieren mehrere katalytischen Untereinheiten ^5,6. Diese ε-vermittelte Regulierung ist spezifisch für bakterielle ATP-Synthase und wird nicht in der mitochondrialen Homolog beobachtet. ATP-Synthase hat als Ziel für antibakterielle Medikamente entstanden, wie die jüngsten FDA-Zulassung von bedaquiline zu arzneimittelresistenten Tuberkulose zu behandeln ⁷ gezeigt. So Targeting ε die hemmende Rolle für die Wirkstoffforschung konnte die antibakterielle die mitochondriale ATP-Synthase nicht hemmen ergeben. Mit dem isolierten katalytischen Komplex (F _1), εwird zu einem dissoziierbares Untereinheit. Doch mit ε F ₁ gebunden ist, der kann einen dramatischen εCTD Konformationsänderung unterziehen, teilweise in zentralen Hohlraum des Enzyms Einfügen und Bildung eines hemmenden Zustand, die wahrscheinlich nicht direkt ^6,8 distanzieren ist. Wir verwenden BLI Kinetik der F ₁ / ε-Bindung und Dissoziation zu messen, und indirekt an allosterische Effekte von katalytischen-Ort-Liganden auf die ε-Konformation zu untersuchen.

In unserem System wurde ε für die Immobilisierung auf der Sensoroberfläche, da BLI-Signal (wie SPR) ausgewählt ist empfindlich gegenüber der Masse der Bindungsmoleküle an der Oberfläche. Die ε-Untereinheit ist klein (~ 15 kDa) gegenüber dem Haupt F _1-Komplex (~ 347 kDa). Somit wird eine größere BLI Signal aus der Bindung an immobilisiertes F ₁ ε führen. Um F ₁ Dissoziation, die sehr langsam sein kann überwachen, müssen ε stark immobilisiert werden. So entschieden wir uns für biotinylierenUnd Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren. Proteine ​​können durch (i) zufällige Modifikation der Oberfläche Lysine ^9, (ii) Umsetzung einer einzigartigen nativen oder gentechnisch Cystein mit einem Biotin-Maleimid-Reagenz ¹⁰ oder (iii) Zugabe einer genetisch bestimmten Biotin-Akzeptor-Peptid, das enzymatisch biotinyliert wird während biotinyliert in vivo-Expression des markierten Proteins ^11. In unserem System wird ε (iii) ⁸ unter Verwendung von Verfahren biotinyliert. Sobald Biotin-markierten ε auf Streptavidin immobilisiert Sensoren können BLI die Bindung und Dissoziation von F _1, die von ε-Untereinheit (F ₁ (-ε)) abgereicherte messen. Für die hier beschriebenen Experimente war vorläufigen Tests durchgeführt, um angemessene Mengen des biotinylierten Proteins zu bestimmen, um auf die Sensoren zu immobilisieren. Dies kann variieren, abhängig von dem Molekulargewicht des Proteins und seinem Bindungspartner, aber das Ziel ist, eine minimale Menge an immobilisiertem Protein t bestimmenHat bietet (i) akzeptable Signal-zu-Rauschen für Bindungskinetik mit einer niedrigen Konzentration des Bindungspartners (nachfolgend K _D) und (ii) minimale Verzerrung Bindungskinetik mit nahezu Sättigungskonzentration des Bindungspartners. Auch kann Stöchiometrie Biotinylierungsgrad variieren (aber vermeiden> 1 Mol Biotin / Mol Protein), so dass einige erste Test kann für jede neue Charge von biotinyliertem Protein benötigt werden, um zu bestätigen, dass eine konsistente BLI-Signal kann während der Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten erreicht werden Sensoren.