Bio-couche interférométrie pour Cinétique des interactions protéine-protéine et allostériques Effets ligand mesure

Interactions protéine-protéine sont importantes pour de nombreux processus biologiques, et les méthodes optiques sans étiquette comme résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisés in vitro pour étudier la cinétique de liaison et de dissociation ^1. La plupart des méthodes sans étiquette immobiliser une biomolécule sur une surface du capteur et d'utiliser un signal optique pour détecter un partenaire de liaison à partir de la solution telle qu'elle s'associe à la biomolécule immobilisée ^1. Bien que SPR est une méthode très sensible, elle est sujette à des interférences dues à des changements dans l'indice de réfraction de la solution s'écoulant sur ​​le capteur ^2. Bien que pas aussi sensible que SPR, Bio-couche interférométrie (BLI) est moins affectée par des changements dans la composition de l'échantillon ^1,3. BLI utilise des biocapteurs à fibres optiques qui ont un revêtement biocompatible propriétaire à la pointe. Le système utilisé ici (Octet-RED96) contient huit spectrophotomètres. La lumière blanche est canalisée vers une rangée de sondes qui se déplacent sur un bras robotisé. Capteurs à fibre optique are captés par les sondes et déplacé à une plaque de 96 puits contenant des échantillons. L'une des molécules cibles est immobilisé sur la surface du biocapteur. Puis capteurs sont déplacés aux puits contenant le partenaire de liaison en solution. BLI surveille association du partenaire de liaison avec la molécule immobilisée, puis surveille dissociation après le déplacement des capteurs de solution sans le partenaire de liaison. La liaison de molécules à la surface du biocapteur conduit à des changements de l'interférence optique entre les ondes lumineuses qui reflètent vers les spectrophotomètres à partir d'une surface interne et externe à partir de l'interface entre le capteur et la solution. Ces changements dans les interférences peuvent être quantifiés et utilisés pour déterminer les taux cinétiques de liaison et de dissociation, résumées dans l'animation de la figure 1.

Nous avons appliqué BLI pour mesurer les interactions entre le complexe catalytique de l'ATP synthase bactérienne et sa sous-unité ε, qui peut auto-inhiber l'enzyme. ATP synthase est un nanomoteur rotatif enrobé dans une membrane qui catalyse la synthèse et l'hydrolyse de l'ATP ^4. Le complexe catalytique (F ₁₎ peut être isolé sous une forme soluble qui fonctionne comme une ATPase. Sous-unité ε a deux domaines: le domaine N-terminal (NTD) est nécessaire pour un montage correct et couplage fonctionnel de l'enzyme mais n'interagit pas directement avec les sous-unités catalytiques; du domaine C-terminal (CTD) peut inhiber l'enzyme en interagissant avec de multiples sous-unités catalytiques ^5,6. Ce règlement de ε-médiation est spécifique à ATP synthases bactériennes et n'est pas observée dans l'homologue mitochondrial. ATP synthase a apparu comme une cible pour les médicaments antibactériens, comme le montre la récente approbation de la FDA de bedaquiline pour traiter la tuberculose résistante aux médicaments ^7. Ainsi, le ciblage rôle inhibiteur de ε pour la découverte de médicaments pourrait donner antibactériens qui ne inhibent l'ATP synthase mitochondriale. Avec le complexe catalytique isolé (F _1), εdevient une sous-unité indissociable. Cependant, avec ε lié à F _1, la εCTD peut subir un changement de conformation dramatique, insertion partielle dans la cavité centrale de l'enzyme et la formation d'un état ​​d'inhibition qui est peu probable de dissocier directement ^6,8. Nous utilisons BLI pour mesurer la cinétique de F ₁ / ε liaison et de dissociation, et indirectement, pour examiner les effets allostériques du site catalytique ligands sur la conformation de ε.

Dans notre système, ε a été choisie pour l'immobilisation sur la surface du capteur étant donné que le signal BLI (comme SPR) est sensible à la masse des molécules de liaison à la surface. La sous-unité ε est petit (~ 15 kDa) par rapport à la principale F ₁ complexe (~ 347 kDa). Ainsi, un signal de plus grande BLI va résulter de la liaison de F ₁ à ε immobilisé. Afin de surveiller F ₁ dissociation, qui peut être très lent, ε doit être fermement immobilisée. Ainsi nous avons choisi de biotinylerEt l'immobiliser sur biocapteurs revêtues de streptavidine. Les protéines peuvent être biotinylés par (i) la modification aléatoire des lysines de surface ^9, (ii) réaction d'une cystéine natif ou composite unique avec un réactif de biotine-maléimide ¹⁰ ou (iii) l'addition génétiquement un peptide biotine-accepteur spécifique qui est enzymatiquement biotinylé pendant l'expression in vivo de la protéine marquée ^11. Dans notre système, ε est biotinylé en utilisant la méthode (iii) ^8. Une fois ε-biotine marqué est immobilisé sur des capteurs de streptavidine, BLI peut mesurer la liaison et la dissociation de F ₁ qui a été épuisée de la sous-unité ε (F ₁ (-ε)). Pour les expériences décrites ici, des essais préliminaires ont été faites pour déterminer des quantités raisonnables de la protéine biotinylé à immobiliser sur les capteurs. Cela peut varier, en fonction du poids moléculaire de la protéine et son partenaire de liaison, mais le but est de déterminer une quantité minimale de protéine immobilisée tchapeau fournit (i) acceptable signal sur bruit pour la cinétique de liaison avec une faible concentration du partenaire de liaison (K _D ci-dessous) et (ii) un minimum de distorsion de la cinétique de liaison de concentration quasi-saturation du partenaire de liaison. En outre, la stoechiométrie de biotinylation peut varier (mais évitez> 1 mole de biotine / protéine mol), de sorte que certains dosage initial peut être nécessaire pour chaque nouveau lot de protéines biotinylé pour confirmer qu'un signal BLI convergentes peut être réalisé au cours de l'immobilisation sur la streptavidine capteurs.