Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori
Summary
Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.
Abstract
Dettagli Questo protocollo un metodo per analizzare la capacità di progenitori ematopoietici purificati per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) in cerotto intestinale del Peyer (PP). Progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP, lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) sono state purificate dal midollo osseo di topi C57BL6 da FACS e trasferiti a topi riceventi che mancano di una popolazione significativa PDC in PP, in questo caso, IFNAR – / – topi sono stati usati come destinatari di trasferimento. In alcuni topi, l'iperespressione del fattore di crescita delle cellule dendritiche ligando di Flt3 (Flt3L) è stato applicato prima adottivi trasferimento di CDP, utilizzando idrodinamica trasferimento di geni (HGT), del Flt3L-plasmide codificante. Flt3L sovraespressione espande popolazioni DC provenienti dalla trasferiti (o endogeni) progenitori ematopoietici. A 7-10 giorni dopo il trasferimento progenitore, pDCs che nascono dai progenitori adoptively ceduti sono stati distinti da cellule riceventi sullabase di espressione marcatore CD45, con pDCs da CDP trasferiti essere CD45.1 + e destinatari di essere CD45.2 +. La capacità di CDP trasferiti a contribuire alla popolazione pDC in PP e di rispondere alle Flt3L è stata valutata mediante citometria a flusso di PP sospensioni di cellule singole da topi riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per verificare se altre popolazioni progenitrici sono in grado di generare PP pDCs. Inoltre, questo approccio potrebbe essere utilizzato per esaminare il ruolo dei fattori che si prevede di influenzare lo sviluppo PDC in PP, trasferendo sottoinsiemi progenitrici con un atterramento opportuno, knockout o sovraespressione del fattore putativo di sviluppo e / o manipolando citochine circolanti via HGT . Questo metodo può anche permettere un'analisi di come pDCs PP influenzano la frequenza o la funzione di altri sottoinsiemi immuni in PP. Una caratteristica unica di questo metodo è l'uso di IFNAR – / – mice, che mostrano gravemente impoverito PP pDCs relative al tipo di animali selvatici, così allowing ricostituzione di PP pDCs in assenza di effetti confondenti da irradiazione letale.
Introduction
Qui, dimostriamo un protocollo per valutare se progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP) sono in grado di dare luogo alla cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC), la popolazione in patch di Peyer (PP). L'obiettivo generale di questo metodo è stato quello di valutare la regolamentazione dello sviluppo di pDCs in patch di Peyer (PP pDCs). Il motivo per questo è importante è che pDCs PP differiscono da pDCs trovati in altri tessuti, compreso il midollo osseo, sangue e milza, e pertanto non è chiaro se pDCs PP e altre popolazioni PDC sono evolutivamente e / o funzionalmente connesse. In particolare, pDCs sono ampiamente conosciuto per essere il principale tipo I (IFN) i produttori all'interno del sistema ematopoietico, rispondendo a Toll-like receptor 7 e 9 (TLR7 / 9) stimolazione da una rapida secrezione di IFN 1-3. Tuttavia, pDCs PP sono carenti nella produzione di IFN di tipo I in risposta alla stimolazione TLR agonisti 4,5. Inoltre, PP pDCs anche differire dal pDCs trovano nel midollo osseo e nella milza inrichiede segnali dal interferone di tipo I (IFN) recettore (IFNAR1) o la IFN segnalazione STAT1 molecola per il loro sviluppo e / o l'accumulo 5. Questi dati hanno suggerito la possibilità che meccanismi regolatori distinti controllano pDCs PP rispetto pDCs in altri organi (pe midollo osseo, milza) 5.
La logica che ha portato allo sviluppo di questo metodo è basata sui recenti progressi nella comprensione delle cellule dendritiche (DC) biologia. La maggior parte, se non tutti, i sottoinsiemi DC derivano da progenitori ematopoietici che esprimono il tipo fms recettore tirosina chinasi 3 (Flt3) 6-10, tuttavia, lo sviluppo DC non è limitato al classico mieloidi e linfoidi percorsi. Ad esempio, Flt3 + progenitori mieloidi comuni (CMP, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcγR lo / -) dare adito a CDP (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +); la cucih ulteriormente differenziarsi in pDCs e DC convenzionali (CDC) 9,10. Al contrario, Flt3 + progenitori linfoidi comuni (CLPS, Lin – IL-7R + Sca-1 lo c-kit LO) si sviluppano principalmente in pDCs 11. Pertanto, studi precedenti indicano pDCs derivano da almeno due distinte popolazioni progenitrici ematopoietiche ai sensi del regolamento di Flt3L, anche se l'analisi tipica è stato limitato al midollo osseo, milza e / o sottoinsiemi pDC sangue. Così, la popolazione progenitore (s) che genera PP pDCs necessaria indagine. Comprendere le origini del PP pDCs farà luce su se condividono percorsi di sviluppo comuni con altre popolazioni PDC o utilizzare meccanismi distinti durante la loro generazione in PP.
Un vantaggio unico dell'approccio descritto è l'uso di topi che mostrano una carenza grave in PP pDCs come destinatari del trasferimento adottivo di progenitori emopoietici. I topi con il genedelezione tic nel gene che codifica IFNAR1 (IFNAR – / – mice) o STAT1 (Stat1 – / -) ha rivelato un impoverimento notevole in PP pDCs 5. Pertanto, questi ceppi forniscono un ambiente in cui pDCs PP sono ridotte, consentendo studi trasferimento adottivo da eseguire in assenza di potenti regimi ablazione cellulare come irradiazione letale. Un ulteriore punto di forza del metodo qui presentato è l'uso di idrodinamica trasferimento genico (HGT) stimolare elevate quantità circolanti di Flt3L. Ciò fornisce un metodo conveniente per indurre Flt3L in vivo, rispetto iniezione di proteina ricombinante. Numerosi studi, compresi quelli nel nostro laboratorio, hanno impiegato HGT per indurre la quantità di citochine in una varietà di condizioni sperimentali 5,12,13.
La divisione del lavoro e precise funzioni immunitarie per DC è di grande interesse nel campo dell'immunologia. In particolare, pDCs sono importanti mediatori della tolleranza orale e sistemica antiviralerisposte, ma sembrano anche contribuire allo sviluppo e la persistenza di autoimmunità e cancro 14-17. Il protocollo qui descritto permetterà i meccanismi evolutivi che regolano PP pDCs ad essere più pienamente esplorate. Inoltre, questo approccio può consentire studi per valutare la funzione PP pDC, e può essere esteso a comprendere la regolamentazione e la funzione delle altre popolazioni immunitarie all'interno PP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica qui descritta trasferimento adottivo valutato il contributo della CDP alla popolazione PP pDC in topi riceventi che sono carenti in PP pDCs (es IFNAR – / – topi). In esperimenti futuro, sarà importante per valutare il potenziale di altri sottoinsiemi progenitrici nel generare pDCs PP, in particolare se pDCs PP derivano da Flt3 + CLPS. Questa domanda è significativa in quanto non è chiaro il motivo per cui pDCs PP sono unicamente sensibili ai segnali IFNAR-STAT1 per PP accanto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Alex Gelbard e Willem Overwijk consigli su trasferimento genico idrodinamica. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (AI098099, SSW), l'MD Anderson Cancer Center for epigenetica, l'MD Anderson Center for infiammazione e cancro (SSW), e il Bob Smith Education Fund RE (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
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