Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers
Summary
Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.
Abstract
Dit protocol detailleert een methode om het vermogen van gezuiverd hematopoëtische voorlopers aan plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) in intestinale Peyer's Patch (PP) genereren analyseren. Gemeenschappelijke dendritische cel voorlopers (CDP, lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) werden gezuiverd uit het beenmerg van C57BL6 muizen door FACS en overgebracht naar ontvangende muizen die een aanzienlijke pDC bevolking PP beschikken, in dit geval, IFNAR – / – muizen werden als ontvangers overdracht. In sommige muizen, werd overexpressie van de dendritische cel groeifactor Flt3 ligand (Flt3L) voorafgaand aan de overdracht van de CDP adoptief afgedwongen, met behulp van hydrodynamische genoverdracht (HGT) van Flt3L-codering plasmide. Flt3L overexpressie breidt DC populaties afkomstig van overdracht (of endogene) hematopoëtische voorlopers. Op 7-10 dagen na voorlopercellen overdracht is pDCs die voortkomen uit de adoptief overgedragen voorlopers onderscheiden van ontvangende cellen op debasis van CD45 marker expressie, met pDCs uit overgedragen CDP's zijn CD45.1 + en ontvangers zijn CD45.2 +. Het vermogen overgedragen CDP bijdragen aan de PDC bevolking PP en reageren Flt3L werd geëvalueerd door flowcytometrie PP enkelvoudige celsuspensies van ontvangende muizen. Deze werkwijze kan worden getoetst of andere populaties voorlopercellen kunnen genereren PP pDCs. Bovendien kan deze benadering worden gebruikt om de rol van factoren die voorspeld beïnvloeden pDC ontwikkeling PP, door overdracht progenitor subsets met een geschikt knockdown, knockout of overexpressie van de vermeende ontwikkelingsfactor en / of door het manipuleren van circulerende cytokinen via HGT onderzocht . Deze methode kan ook de analyse van de manier waarop PP pDCs invloed op de frequentie of de functie van andere immuun subsets in PPs mogelijk te maken. Een uniek kenmerk van deze methode is het gebruik van IFNAR – / – muizen, die ernstig uitgeput PP pDCs opzichte van wildtype dieren, waardoor allowi tonenng reconstitutie van PP pDCs in afwezigheid van verstorende effecten van letale bestraling.
Introduction
Hier tonen we een protocol om te beoordelen of gemeenschappelijke dendritische cel voorlopers (CDP's) in staat zijn die aanleiding geven tot de plasmacytoide dendritische cel (PDC) bevolking in de Peyer's patch (PP). Het algemene doel van het gebruik van deze methode was om de ontwikkelingsdoelen regulering van pDCs in Peyer's patch (PP pDCs) te evalueren. De reden dat dit belangrijk is dat PP pDCs verschillen pDCs gevonden in andere weefsels, zoals beenmerg, bloed en milt, en daarom is het onduidelijk of PP pDCs en andere pDC populaties ontwikkelingsgebied en / of functioneel gerelateerd. Specifiek worden pDCs alom bekend als de belangrijkste type I interferon (IFN) producenten binnen het hematopoietische systeem, het reageren op Toll-like receptor 7 en 9 (TLR7 / 9) stimulatie door snelle IFN secretie 1-3. Echter, PP pDCs zijn deficiënte type I IFN reactie op TLR agonist stimulatie 4,5. Bovendien PP pDCs ook verschillen pDCs gevonden in beenmerg en miltwaarbij signalen van het type I interferon (IFN)-receptor (IFNAR1) of IFN-signalerend molecuul STAT1 voor hun ontwikkeling en / of accumulatie 5. Deze gegevens hebben de mogelijkheid dat verschillende regulerende mechanismen beheersen PP pDCs versus pDCs in andere organen (bijvoorbeeld beenmerg, milt) 5 voorgesteld.
De reden die leidde tot de ontwikkeling van deze methode was gebaseerd op de recente vooruitgang in het begrip dendritische cel (DC) biologie. De meeste, zo niet alle, DC subsets afkomstig van hematopoëtische voorlopers die het FMS-achtige tyrosinekinase receptor 3 (Flt3) 6-10 expressie, maar is DC ontwikkeling niet beperkt tot de klassieke myeloïde en lymfoïde wegen. Bijvoorbeeld, Flt3 + gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcyR lo / -) aanleiding geeft tot CDPs (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +), which verder differentiëren in pDCs en conventionele DC (CDC) 9,10. Daarentegen Flt3 + gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen (CLPs, lin – IL-7R + SCA-1 lo c-kit lo) ontwikkelen voornamelijk in pDCs 11. Daarom voorafgaande studies geven pDCs voortvloeien uit minstens 2 verschillende hematopoietische voorlopercellen bevolking onder de regulering van Flt3L, hoewel de typische analyse is beperkt tot het beenmerg, de milt en / of bloed pDC subsets. Zo is de stamvader populatie (s) die PP pDCs genereert vereist onderzoek. Begrijpen van de oorsprong van PP pDCs zal licht werpen op de vraag of zij gemeenschappelijke ontwikkelingstrajecten met andere pDC bevolking, of gebruik maken van verschillende mechanismen tijdens hun generatie in PP.
Een uniek voordeel van de hierin beschreven benadering is het gebruik van muizen die een ernstig tekort in PP pDCs als ontvangers voor de adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers tonen. Muizen met gentic deletie in het gen dat codeert IFNAR1 (IFNAR – / – muizen) of STAT1 (Stat1 – / -) bleek een opvallende afname in PP pDCs 5. Daarom zijn deze stammen bieden een omgeving waarin PP pDCs gereduceerd, waardoor adoptieve overdracht studies bij afwezigheid van krachtige cel ablatie regimes als letale bestraling worden uitgevoerd. Een extra sterkte van de hier gepresenteerde methode het gebruik van hydrodynamische genoverdracht (HGT) verhoogde circulerende hoeveelheden Flt3L stimuleren. Dit levert een rendabele aanpak Flt3L induceren in vivo versus injectie van recombinant eiwit. Talrijke studies, waaronder die in ons laboratorium hebben HGT gebruikt om cytokine bedragen induceren in een verscheidenheid van experimentele omstandigheden 5,12,13.
De verdeling van arbeid en precieze immuunfuncties voor ontwikkelingslanden is van groot belang in de immunologie. Vooral pDCs zijn belangrijke mediatoren van orale tolerantie en systemische antiviralereacties, maar ze lijken ook bijdragen aan de ontwikkeling en persistentie van auto-immuniteit en kanker 14-17. De hierin beschreven protocol zal de ontwikkeling mechanismen tot regeling van PP pDCs meer te worden onderzocht. Bovendien kan deze aanpak laten studies naar PP PDC-functie te beoordelen, en kan worden uitgebreid tot het begrip van de regulatie en functie van andere immuun-populaties in PP.
Protocol
Representative Results
Discussion
De adoptieve overdracht techniek hierin beschreven onderzocht de bijdrage van CDP aan de PP pDC bevolking in de ontvangende muizen die deficiënt zijn in PP pDCs zijn (bv. IFNAR – / – muizen). In toekomstige experimenten, zal het belangrijk zijn om de mogelijkheden van andere voorlopercellen subsets te evalueren in het genereren van PP pDCs, met name of PP pDCs ontlenen Flt3 + CLPs. Deze vraag is belangrijk, want het blijft onduidelijk waarom PP pDCs zijn uniek gevoelig voor IFNAR-STAT1 si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Alex Gelbard en Willem Overwijk voor advies over hydrodynamische gentransfer. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (AI098099, SSW), het MD Anderson Cancer Center for Epigenetica, de MD Anderson Centrum voor kanker en inflammatie (SSW), en de RE Bob Smith Fund Onderwijs (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
