Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques
Summary
Ce protocole décrit les procédures expérimentales pour évaluer la différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer de progéniteurs de cellules dendritiques ordinaires, en utilisant des techniques impliquant l'isolement FACS à médiation cellulaire, le transfert de gène hydrodynamique, et l'analyse des flux de sous-ensembles immuns dans les plaques de Peyer.
Abstract
Ce protocole détaille une méthode pour analyser la capacité des progéniteurs hématopoïétiques purifiées pour produire des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans le patch de Peyer intestinale (PP). Progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS, lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) ont été purifiés à partir de la moelle osseuse de souris C57BL6 par FACS et transférés à des souris receveuses qui n'ont pas une population pDC significative en PP, dans ce cas, IFNAR – / – souris ont été utilisés comme les bénéficiaires de transferts. Chez certaines souris, la surexpression du facteur de croissance dendritique des cellules ligand Flt3 (Flt3L) a été appliqué avant le transfert adoptive de lecteurs de disques compacts, en utilisant le transfert de gène hydrodynamique (HGT) de Flt3L plasmide codant. Flt3L surexpression augmente populations de DC provenant de transférés (ou endogènes) progéniteurs hématopoïétiques. À 7-10 jours après le transfert de l'ancêtre, pDCs qui découlent des progéniteurs adoptive transférés ont été distinguées des cellules réceptrices sur labase de l'expression du marqueur CD45, avec pDCs du CDP transférés étant CD45.1 + et les bénéficiaires étant CD45.2 +. La capacité des lecteurs de disques compacts transférés à contribuer à la population pDC en PP et de répondre à Flt3L a été évaluée par cytométrie de flux de PP suspensions de cellules isolées à partir de souris receveuses. Cette méthode peut être utilisée pour tester si d'autres populations de cellules progénitrices sont capables de générer PP pDC. En outre, cette approche pourrait être utilisée pour examiner le rôle des facteurs qui sont prévus pour affecter le développement pDC en PP, en transférant des sous-ensembles de souches avec un effet de choc, coup de grâce ou la surexpression appropriée du facteur et / ou de développement putatif en manipulant cytokines circulantes par HGT . Cette méthode peut également permettre une analyse de la façon dont les pDC PP affectent la fréquence ou la fonction de sous-ensembles d'autres immunitaires en PP. Une caractéristique unique de cette méthode est l'utilisation de IFNAR souris – / -, qui montrent gravement appauvri PP pDC par rapport à des animaux de type sauvage, ainsi allowing reconstitution de PP pDC en l'absence d'effets confondants de l'irradiation mortelle.
Introduction
Ici, nous démontrons un protocole pour évaluer si progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS) sont capables de donner naissance à la cellule dendritiques plasmacytoïdes (pDC) de la population dans les plaques de Peyer (PP). L'objectif global de cette méthode est d'évaluer la régulation du développement des pDC dans les plaques de Peyer (PP pDC). La raison pour cela est important, c'est que les pDC PP diffèrent de pDC trouvés dans d'autres tissus, y compris la moelle osseuse, du sang et de la rate, et il est donc difficile de savoir si les pDC PP et d'autres populations PDC sont de développement et / ou fonctionnellement liés. Plus précisément, les pDC sont largement connus pour être le principal type I interféron (IFN) producteurs dans le système hématopoïétique, répondant au récepteur Toll-like 7 et 9 (TLR7 / 9) par stimulation rapide sécrétion d'IFN 1-3. Toutefois, les pDC PP sont déficientes dans la production de IFN de type I en réponse à la stimulation agoniste TLR 4,5. En outre, PP pDCs diffèrent également des pDC présentes dans la moelle osseuse et la rate dansnécessitant des signaux provenant du interféron de type I (IFN) récepteur (IFNAR1) ou l'IFN de signalisation STAT1 molécule pour leur développement et / ou l'accumulation 5. Ces données ont suggéré la possibilité que des mécanismes de régulation distincts contrôlent pDCs PP contre pDC dans d'autres organes (par exemple, la moelle osseuse, la rate) 5.
Le raisonnement qui a conduit à la mise au point de ce procédé a été basé sur les avancées récentes dans la compréhension de cellule dendritique (DC) de la biologie. La plupart, sinon la totalité, des sous-ensembles DC dérivent de progéniteurs hématopoïétiques qui expriment le récepteur de tyrosine kinase 3 de type fms (Flt3) 6-10, mais le développement à courant continu n'est pas limitée à l'myéloïde voies classique et lymphoïdes. Par exemple, Flt3 + progéniteurs myéloïdes communs (CMPS, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FCyR lo / -) donner lieu à CDP (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +), which différencier davantage dans les pDC et DC classiques (CDCS) 9,10. En revanche, Flt3 + progéniteurs lymphoïdes communs (SPDP, lin – + Sca-1 lo c-kit IL-7R lo) se développent principalement dans les pDC 11. Par conséquent, des études antérieures indiquent pDCs proviennent d'au moins deux populations de cellules progénitrices hématopoïétiques distincts en vertu de la réglementation des Flt3L, bien que l'analyse typique a été limitée à la moelle osseuse, la rate et / ou des sous-ensembles de PDC sang. Ainsi, la population (s) de l'ancêtre qui génère PP pDCs requis enquête. Comprendre les origines de la PP pDCs fera la lumière sur si ils partagent les voies de développement communs avec d'autres populations pDC, ou utiliser des mécanismes distincts au cours de leur génération en PP.
Un avantage unique de l'approche décrite ici est l'utilisation de souris qui présentent un déficit sévère en PP pDCs que les destinataires du transfert adoptif progéniteurs hématopoïétiques de. Les souris avec le gènetic deletion dans le gène codant pour IFNAR1 (IFNAR – / – souris) ou STAT1 (Stat1 – / -) a révélé une diminution frappante dans les pDC PP 5. Par conséquent, ces souches fournissent un environnement dans lequel les pDC PP sont réduites, ce qui permet des études de transfert adoptif à effectuer en l'absence de régimes d'ablation de cellules puissants tels que l'irradiation létale. Une résistance supplémentaire de la méthode présentée ici consiste à utiliser du transfert de gène hydrodynamique (HGT) pour stimuler des quantités circulantes élevées de Flt3L. Ceci fournit une approche rentable pour induire Flt3L in vivo, par rapport à l'injection de la protéine recombinante. De nombreuses études, y compris celles de notre laboratoire, ont utilisé HGT pour induire des quantités de cytokines dans une variété de conditions expérimentales 5,12,13.
La division du travail et les fonctions immunitaires précises pour les PED est d'un intérêt majeur en immunologie. En particulier, les pDC sont des médiateurs importants de la tolérance orale et systémique anti-viraleréponses, pourtant ils semblent également contribuer au développement et la persistance de l'auto-immunité et le cancer de 14 à 17. Le protocole décrit ici permettra les mécanismes de développement de régulation PP pDCs d'être étudiées plus en détail. En outre, cette approche peut permettre des études pour évaluer la fonction PP pDC, et peut être étendu à la compréhension de la régulation et la fonction des autres populations immunitaires dans les PP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique du transfert adoptif décrit ici a évalué la contribution de la population de CDP PP pDC dans des souris receveuses qui sont déficientes en PP pDC (par exemple IFNAR – / – souris). Dans les expériences à venir, il sera important d'évaluer le potentiel d'autres sous-ensembles de souches à générer pDCs PP, en particulier si les pDC PP proviennent de Flt3 + PLC. Cette question est importante, car on ne sait pas pourquoi pDCs PP sont particulièrement sensibles au…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Alex Gelbard et Willem Overwijk pour obtenir des conseils sur le transfert de gène hydrodynamique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (AI098099, SSW), le Centre MD Anderson Cancer de l'épigénétique, le Centre MD Anderson pour l'inflammation et le cancer (SSW), et le Fonds RE Bob Smith éducation (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
