Stærkt Løst Intravital Striped-belysning mikroskopi af kimcentre
Summary
Høj opløsning intravital billeddannelse med forbedret kontrast op til 120 um dybde i lymfeknuder voksne mus opnås ved rumligt at modulere excitation mønster af en multifokal to-foton mikroskop. I 100 um dybde målt vi beslutninger af 487 nm (laterale) og 551 nm (aksialt), derved omgå spredning og diffraktion grænser.
Abstract
Overvågning cellulær kommunikation ved intravital dybtliggende væv multi-foton mikroskopi er nøglen til at forstå den skæbne immunceller inden tykke vævsprøver og organer i sundhed og sygdom. Ved at styre scanning mønster i multi-foton mikroskopi og anvende passende numeriske algoritmer, udviklede vi en stribet-belysning tilgang, som gjorde det muligt for os at opnå 3-fold bedre aksial opløsning og forbedret signal-til-støj-forhold, dvs kontrast på mere end 100 mM vævsdybde indenfor stærkt spredende væv af lymfoide organer i forhold til standard multi-foton mikroskopi. Købet hastighed samt fotoblegning og solskader effekter var magen til standard foto-multiplikator-baserede teknik, mens den billeddannende dybde var lidt lavere på grund af brugen af marken detektorer. Ved at bruge den stribede-belysning tilgang, er vi i stand til at observere dynamikken i immunkompleksaflejringer på sekundære follikulære dendritiske celler ̵1; på niveauet af nogle få proteinmolekyler i kimcentre.
Introduction
To-foton laser-scanning mikroskopi (TPLSM), med dens fordele for dybtliggende væv billedbehandling relateret til infrarød ultrakorte pulserende excitation 1, har revolutioneret vores syn på vitale processer på en enkelt-celle niveau ved at afsløre motilitet og interaktion mønstre af forskellige celledelmængder i levende dyr 2-5. Men den nuværende teknologi er stadig utilstrækkelig til at belyse de mekanismer, organfunktion og dysfunktion som en forudsætning for udvikling af nye terapeutiske strategier, idet den gør kun sparsomme oplysninger om den molekylære basis for cellulære svar inden væv i sundhed og sygdom. Moderne teknologi muliggør kun en rumlig vindue af få hundrede mikrometer grundet spredning og Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængning effekter på rumlig opløsning og signal-til-støj-forhold 6, som er særligt tydeligt i meget kompakt væv af voksne dyr. Disse spredning og Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængning effekter skyldes en meget heterogen end anisotropisk fordeling af brydningsindekset i væv, hvilket i et første skridt til en dybde afhængig forringelse af 3D rumlig opløsning og endelig til det samlede tab af signal, der stammer fra ballistiske excitation fotoner, dvs tab af signal-til-støj-forhold. Med hensyn til biovidenskabelig og biomedicinske dybe væv applikationer, betyder det, at den nuværende teknologi er i stand til utvetydigt afslører cellulær kommunikation, fordi dårlig opløsning ville føre til falsk positive samspil mens reduktionen af signal-til-støj-forhold vil få systemet til at overse nogle interaktioner mellem dim strukturer.
For at utvetydigt afsløre cellulære interaktioner på en dynamisk måde, er der behov for et stærkt forbedret rumlig opløsning dybt i vævet. De aktuelt indført kraftfulde Nanoscopy teknikker baseret på særlige numeriske algoritmer, fx struktur-belysning adgangsveje på udtynding af den første exciterede tilstand, fx </em> STED, RESOLFT eller på molekyle lokalisering, fx dSTORM, Palm, har fundet mange anvendelser i faste celler såvel som i levende cellekulturer 7. Men for at udvide disse programmer til vævssnit, levende væv og organismer vi stadig nødt til at overvinde alvorlige tekniske problemer. To-foton excitation place med forskellige bølgelængder samt med en enkelt bølgelængde (sw2PE-STED) til excitation og stimuleret emission er blevet anvendt til at forbedre lateral opløsning i hjernesnit 8 eller i kunstige matricer med indlejrede celler 9, henholdsvis på samme aksial opløsning som standard TPLSM. Ved hjælp af en-foton STED kunne dynamik dendritiske spidser blive afbildet på overfladen af hjernebarken (op til 10-15 um dybde) i et levende Thy1 EGFP mus med en opløsning på 67 nm 10. Et alsidigt værktøj til udviklingsmæssige biologi tilvejebringes af den multifokale strukturerede belysning mikroskopi, som giver to gange forbedret 2Dopløsning. Dog kan denne teknik kun anvendes i organismer med en lav tilbøjelighed til lysspredning såsom zebrafisklarver 11. Alligevel kan ingen af disse teknikker skal anvendes i stærkt spredende væv af voksne dyr i flere hundrede mikrometer, som er afgørende modeller for biomedicinsk og klinisk forskning af sygdomme med debut efter fødslen.
Uafhængigt af tilnærmelse bruges til at beregne diffraktionsbegrænset bølgefront facon, dvs punktspredningsfunktionen (PSF), efter fokusering gennem en linse, bredden af PSF langs den optiske akse (aksial opløsning) er mindst tre gange større end PSF bredde vinkelret på den optiske akse (lateral opløsning) 12.. Bølgefrontkorrektionssystemer fordrejninger af forskellige rækkefølger kvantificeret ved Zernike koefficienter væsentligt ændre den bølge foran form af fokuseret elektromagnetisk bølge i dybtliggende væv billeddannelse fører til meget større vævede, især langs den optiskeal kernepunkt 13-15. Derfor både diffraktion love og bølgefronten forvridninger peger på opløsning langs den optiske akse som den begrænsende faktor i dybtliggende væv billeddannelse. Betragtninger Nanoscopy teknikker fokus på at modvirke grænserne for diffraktion kun er en teknologi, der forbedrer aksial opløsning og kontrast ved at modvirke både diffraktion og bølge-front forvrængning effekter er nødvendige for høj opløsning intravital billeddannelse. Ideelt set bør denne teknik også være hurtig nok til at tillade overvågning af cellulære dynamik.
Den real-tid korrektion af PSF aberrationer og kontrast tab ved hjælp af adaptiv optik i TPLSM er blevet grundigt undersøgt og forbedret i det seneste årti 13,14,16-18 og det er derfor i øjeblikket den bedste valg fører til en bedre forvaltning af ballistisk excitation fotoner 14. Still, skyldes, at de fleste Bølgefrontkorrektionssystemer korrektion tilgange anvendes adaptiv optik er iterativ og at de have gentages for små områder (få 10 x 10 um 2) på grund af den høje heterogenitet af brydningsindekset i væv, købet hastighed er betydeligt lavere end nødvendigt til billeddannelse cellemotilitet og kommunikation. Desuden er den fysiske grænse i adaptiv-optik forbedret TPLSM er fortsat bestemt af diffraktion.
Spatial graduering af belysning (SPIN) og tidsmæssige graduering på påvisning side (SPADE) er blevet teoretisk foreslået der skal anvendes på laser-scanning mikroskopi for at forbedre opløsningen. Deres praktiske anvendelse i intravital imaging stadig skal demonstreres 19.
Tilsammen er der stor efterspørgsel efter udvikling af teknologier, som forbedrer opløsningen for dybtliggende væv billeddannelse i levende voksne dyr. I dette arbejde, opnår vi rumlig modulation af excitation mønster ved at styre scanningen i multi-beam stribet-belysning multi-foton laser-skonserves mikroskopi (MB-SI-MPLSM) 20. I modsætning til strukturerede belysning tilgange, hvor exciteringsstrålen tværsnit rumligt modulerede, vi bruger kun den scanning proces at opnå den rumlige modulation af excitation. Ved at udvide excitation til en længere bølgelængde, vi er i stand til at forbedre både rumlig opløsning og signal-støj-forholdet i dyb-væv af stærkt spredende væv (f.eks lymfeknude, frit spredning sti 47 um 6), uafhængigt af den optiske ikke-lineære signal, vi registrerer, fx fluorescens, anden harmonisk generation eller anden frekvens blanding fænomen. Ved hjælp af denne tilgang på excitationsbølgelængder op til 900 nm vi er i stand til dynamisk billede cellulære protein strukturer på omfanget af nogle molekyler i kimcentre af muse lymfeknuder. Således kan vi bedre visualisere samspillet mellem antigen bærer enheder på overfladen af follikulære dendritiske celler og B-celler i processen sondering antigen under immunresponset i sekundære lymfoide organer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med intravital optisk billeddannelse er dynamisk og funktionelt visualisere cellulære motilitet og interaktioner for at forstå væv og organfunktion i sundhed og sygdom 5. Den mest kraftfulde teknologi til at opnå dette, multi-foton laser-scanning mikroskopi, stadig at overvinde begrænsninger i relation til Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængninger, spredning, langsom erhvervelse, fotoblegning og solskader, som begrænser dens rumlige opløsning, kontrast samt dens tid opløsning .
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker R. Heintzmann for frugtbare drøftelser under udviklingen af den stribede-belysning tilgang, K. Rajewsky og A. Haberman for at yde C57BL / 6 B1-8 GFP transgene mus. Vi anerkender Deutsche Forschungsgemeinschaft under tilskud NI1167/3-1 (til RN), HA5354/4-1 og SFB633, projekt A15 (til AEH), Charité under tilskud Rahel-Hirsch-stipendium (til RN) om økonomisk støtte. Vi har især anerkende netværket JIMI for frugtbare diskussioner og infrastrukturelle støtte
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
Referências
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation – stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. . Advanced optical imaging. , (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
