Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Microscopia de varredura a laser de dois fótons (TPLSM), com as suas vantagens para a geração de imagens de tecidos profundos relacionados ao infravermelho excitação pulsada ultra-curto ^1, revolucionou nossa visão sobre os processos vitais em um nível de uma única célula, revelando motilidade e interação de vários padrões subconjuntos de células em animais vivos ^2-5. No entanto, a tecnologia atual ainda é insuficiente para explicar os mecanismos da função de órgãos e disfunção como um pré-requisito para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, uma vez que torna únicas informações esparsas sobre a base molecular da resposta celular nos tecidos na saúde e na doença. A tecnologia actual permite apenas uma janela espaço de algumas centenas de microns, devido ao espalhamento da onda e os efeitos de distorção da frente sobre a resolução espacial e de sinal-para-ruído ^6, que são particularmente evidentes no tecido altamente compacta de animais adultos. Esses efeitos de distorção da frente de dispersão e onda são devido a uma uma grande heterogeneidaded distribuição anisotrópica de o índice de refracção no tecido, conduzindo a um primeiro passo para uma profundidade deterioração depende da resolução espacial 3D e finalmente para a perda total do sinal proveniente de fotões de excitação balísticos, ou seja, a perda de relação de sinal-para-ruído. Em termos de aplicações de tecido profundo biomédicas biotecnocientíficas e, isso significa que a tecnologia atual não é capaz de revelar de forma inequívoca a comunicação celular, porque pobre resolução levaria a interações falsamente positivos enquanto que a diminuição da relação sinal-ruído faria com que o sistema a ignorar alguns interações entre as estruturas fracas.

A fim de detectar de forma inequívoca interações celulares de uma forma dinâmica, uma resolução espacial muito melhorado é necessário profundo no interior do tecido. As técnicas Nanoscopia poderosos atualmente introduzidas com base em algoritmos numéricos especiais, por exemplo, abordagens estrutura de iluminação, sobre o esgotamento do primeiro estado animado, por exemplo, </em> STED, RESOLFT, ou na localização molécula, por exemplo, dSTORM, PALM, encontraram muitas aplicações em células fixas, bem como em culturas de células vivas ^7. No entanto, a fim de estender esses aplicativos para cortes de tecidos, tecidos vivos e organismos ainda precisamos superar as dificuldades técnicas graves. Dois fotões de excitação STED com diferentes comprimentos de onda, bem como com um único comprimento de onda (sw2PE-STED) para a excitação e a emissão estimulada tem sido aplicado para melhorar a resolução lateral em fatias de cérebro ou em ^oito matrizes artificiais com células embutidas ^9, respectivamente, ao mesmo resolução axial como TPLSM padrão. Usando um fotão STED, a dinâmica das espinhas dendriticas pode ser trabalhada na superfície do córtex cerebral (até 10-15 microns de dimensão) de um rato vivo Thy1 EGFP com uma resolução de 67 nm, ^10. Uma ferramenta versátil para a biologia do desenvolvimento é fornecida pela microscopia estruturada-iluminação multifocal, que fornece duas vezes melhorado 2Dresolução. No entanto, esta técnica só pode ser utilizada em organismos com baixa propensão de espalhamento de luz, como embriões de peixe zebra ^11. Ainda, nenhuma destas técnicas pode ser aplicado no tecido altamente espalhamento de animais adultos em várias centenas de micrómetros, que são modelos cruciais para a investigação biomédica e clínica de doenças com inicio após o nascimento.

Independentemente da aproximação usada para calcular a forma da frente de onda de difração limitada, ou seja, a função de contagem de pontos (PSF), concentrando-se depois através de uma lente, a largura do PSF ao longo do eixo óptico (resolução axial) é, pelo menos, três vezes maior do que a largura PSF perpendicular ao eixo óptico (resolução lateral) ^12. Acene distorções da frente de diferentes ordens quantificados por coeficientes de Zernike modificar consideravelmente a forma da frente de onda da onda eletromagnética focado na geração de imagens de tecidos profundos levando a muito maiores PSFs, especialmente ao longo da ópticaal eixo ^13-15. Assim, tanto as leis de difração e os efeitos de distorção da frente de onda apontar para a resolução ao longo do eixo óptico, como o fator limitante na geração de imagens de tecidos profundos. Considerando que as técnicas Nanoscopia concentrar em contrariar os limites da difração só, uma tecnologia que melhora a resolução axial e contraste por contrariar tanto difração e efeitos de distorção de onda-frente é necessária para alta resolução de imagens intravital. Idealmente, esta técnica deve ser igualmente rápido o suficiente para permitir o monitoramento da dinâmica celular.

A correção em tempo real das aberrações do PSF e perda de contraste usando óptica adaptativa em TPLSM tem sido amplamente estudado e melhorado na última década ^13,14,16-18 e, portanto, é a melhor escolha atualmente disponível levando a uma melhor gestão da excitação balístico fótons ^14. Ainda assim, devido ao fato de que a maior onda de correção frente abordagens utilizadas na óptica adaptativa são iterativos e que have ser repetido para pequenas áreas (poucos 10 x 10 um ^2), devido à grande heterogeneidade do índice de refracção no tecido, a velocidade de aquisição é significativamente menor do que o necessário para a motilidade das células de imagiologia e de comunicação. Além disso, o limite físico em ótica adaptativa melhorou TPLSM ainda é determinada por difração.

Modulação espacial de iluminação (SPIN) e modulação temporais no lado de detecção (pá) foram teoricamente proposto para ser aplicada a microscopia de varrimento de laser para melhorar a resolução. A sua aplicação prática em imagens intravital ainda precisa ser demonstrado ^19.

Tomados em conjunto, há uma alta demanda para o desenvolvimento de tecnologias que melhoram a resolução de imagem de tecidos profundos em animais adultos vivos. Neste trabalho, nós conseguimos modulação espacial do padrão de excitação, controlando o processo de digitalização em multi-feixe de risca-de-iluminação multi-fotão de laser-smicroscopia de conservas (MB-SI-MPLSM) ^20. Ao contrário do que as abordagens de iluminação estruturada, em que a secção de excitação travessa é espacialmente modulados, usamos apenas o processo de digitalização para alcançar a modulação espacial da excitação. Ao expandir a excitação de um comprimento de onda mais longo, que são capazes de melhorar a resolução espacial e relação sinal-ruído em tecidos profundos de dispersores tecido (por exemplo, do nó de linfa, o caminho livre de espalhamento de 47 mM ^6), independentemente da óptica sinal não-linear que detectar, por exemplo, de fluorescência, geração de segundo harmônico ou outra freqüência mistura fenômeno. Usando essa abordagem em comprimentos de onda de excitação de até 900 nm, somos capazes de dinamicamente imagem estruturas de proteína celular na escala de algumas moléculas em centros germinativos dos linfonodos do mouse. Assim, podemos visualizar melhor a interacção entre as unidades de antigénio transportando na superfície das células foliculares dendríticas e células B no processo de sondagem do antigen durante a resposta imunitária de órgãos linfóides secundários.