Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM), met zijn voordelen voor deep-tissue imaging gerelateerd aan infrarood ultrakorte gepulste excitatie ^1, heeft een revolutie teweeggebracht in onze visie op vitale processen op een single-cell niveau door de onthulling van de beweeglijkheid en interactiepatronen van verschillende celsubsets levende dieren ^2-5. De huidige technologie is nog onvoldoende om de mechanismen van orgaanfunctie en disfunctie helderen als voorwaarde voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën, want het maakt slechts spaarzame informatie over de moleculaire basis van cellulaire respons op weefsels in gezondheid en ziekte. De huidige technologie maakt slechts een ruimtelijk raam van enkele honderden micrometer door verstrooiing en golffront vervormingseffecten op de ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding ^6, die bijzonder duidelijk in de zeer compacte weefsel van volwassen dieren. Deze verstrooiing en golffront distortion effecten ontstaan ​​door een zeer heterogene eend anisotrope verdeling van de brekingsindex in weefsel, wat in een eerste stap een diepteafhankelijke verslechtering van 3D ruimtelijke resolutie en tenslotte het totale verlies van het signaal afkomstig van ballistische excitatie fotonen, onder meer verloren signaal-ruisverhouding. Qua biowetenschappelijke en biomedische bindweefselmassages toepassingen betekent dit dat de huidige technologie is niet ondubbelzinnig cellulair onthullen vanwege slechte resolutie leidt tot vals positieve interacties terwijl de afname van de signaal-ruisverhouding zou veroorzaken dat het systeem sommige kijken interacties tussen afm structuren.

Teneinde ondubbelzinnig te detecteren cellulaire interacties in een dynamische wijze wordt een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie nodig diep in het weefsel. De momenteel geïntroduceerd krachtige nanoscopy technieken op basis van speciale numerieke algoritmen, zoals structuur-verlichting benaderingen, op uitputting van de eerste aangeslagen toestand, bijv. </em> STED, RESOLFT, of molecuul lokalisatie, bijvoorbeeld dSTORM, PALM, hebben vele toepassingen gevonden in gefixeerde cellen en in levende celculturen ^7. Echter, om deze toepassingen te breiden tot weefselsecties, levend weefsel en organismen we moeten nog ernstige technische problemen te overwinnen. Twee-foton excitatie sted met verschillende golflengtes en met een enkele golflengte (sw2PE-STED) voor excitatie en gestimuleerde emissie is toegepast op laterale resolutie in hersencoupes ⁸ of kunstmatige matrices verbeteren respectievelijk ingebedde cellen ^9, terzelfder axiale resolutie standaard TPLSM. Met een foton STED kan de dynamiek van dendritische worden afgebeeld op het oppervlak van de hersenen cortex (tot 10-15 micrometer diepte) in een levend Thy1 EGFP muis met een resolutie van 67 nm ^10. Een veelzijdig instrument voor ontwikkelingsbiologie wordt door de multifocale gestructureerde verlichting microscopie, die tweevoudige verbeterde 2D geeftresolutie. Echter, deze techniek alleen worden gebruikt in organismen met een lage neiging van lichtverstrooiing zoals zebravis embryo's ^11. Maar geen van deze technieken in zeer verstrooiende weefsel van volwassen dieren worden toegepast in verscheidene honderden micrometers, die cruciaal modellen voor biomedisch en klinisch onderzoek van ziekten die ontstaan ​​na de geboorte.

Onafhankelijk van de benadering gebruikt om de buigingsbegrensde golfvorm voor berekenen, namelijk de puntspreidingsfunctie (PSF), na het scherpstellen door een lens, de breedte van de PSF langs de optische as (axiale resolutie) ten minste drie keer groter is dan de breedte PSF loodrecht op de optische as (laterale resolutie) ^12. Golffront verstoringen van de verschillende orders gekwantificeerd door Zernike coëfficiënten het golffront vorm van gerichte elektromagnetische golf in diep-weefsel beeldvorming leidt tot veel grotere PSF's, met name langs de optische aanzienlijk wijzigenal. as ^13-15. Dus zowel de diffractie wetten en golffront vervormingseffecten wijzen op de resolutie langs de optische as als de beperkende factor in diep weefsel beeldvorming. Overwegende nanoscopy technieken richten zich op het tegengaan van de grenzen van diffractie alleen, een technologie die axiale resolutie en het contrast aan het tegengaan van zowel diffractie en wave-front distortion effecten verbetert nodig is voor hoge-resolutie intravitale beeldvorming. Idealiter zou deze techniek ook snel genoeg om controle van cellulaire dynamiek mogelijk te maken.

De real-time correctie van PSF aberraties en contrast verlies met behulp van adaptieve optiek in TPLSM is uitgebreid bestudeerd en verbeterd in de afgelopen tien jaar ^13,14,16-18 en het is daarom de beste momenteel beschikbare keuze leidt tot een beter beheer van ballistische excitatie fotonen ^14. Toch, vanwege het feit dat de meeste golffront correctie gehanteerde adaptieve optiek iteratief en dat ze hanaar herhaald worden kleine gebieden (enkele 10 x 10 urn ²⁾ vanwege de hoge heterogeniteit van de brekingsindex in het weefsel, de opnamesnelheid aanzienlijk lager dan voor beeldvorming celmotiliteit en communicatie. Bovendien is de fysieke grens in adaptieve optiek verbeterd TPLSM wordt nog bepaald door diffractie.

Ruimtelijke modulatie van verlichting (SPIN) en temporele modulatie op de detectie kant (SPADE) zijn theoretisch voorgesteld moeten worden toegepast op laser scanning microscopie om de resolutie te verbeteren. Hun praktische toepassing in intravitale beeldvorming moet nog worden aangetoond ^19.

Samen genomen, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van technologieën, die de resolutie voor deep-tissue imaging in levende volwassen dieren te verbeteren. In dit werk, we ruimtelijke modulatie van de excitatie patroon door het beheersen van het scanproces in multi-beam gestreept-verlichting multi-foton laser-s te bereikeninblikken microscopie (MB-SI-MPLSM) ^20. Anders gestructureerde verlichting benaderingen, waarbij het gedeelte excitatiebundel kruis ruimtelijk gemoduleerde, gebruiken we alleen het scanproces de ruimtelijke modulatie van de excitatie bereiken. Door de uitbreiding van de excitatie naar een langere golflengte, kunnen we zowel ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding in diep weefsel van sterk verstrooiende weefsel (bijv. lymfeklieren, free-verstrooiing path 47 urn ⁶⁾ te verbeteren, onafhankelijk van de optische niet-lineaire signaal dat we te detecteren, bijvoorbeeld fluorescentie, tweede harmonische generatie of andere frequentie mengen fenomeen. Met deze aanpak op golflengten tot 900 nm kunnen we dynamisch beeld cellulair eiwit structuren op de schaal van enkele moleculen in kiemcentra van muis lymfeklieren. Zo kunnen we beter visualiseren de interactie tussen antigeen dragende eenheden op het oppervlak van folliculaire dendritische cellen en B-cellen in het proces van onderzoeken van het antigen tijdens de immuunrespons bij secundaire lymfoïde organen.