Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров

Двухфотонное лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM), со своими преимуществами для глубокие ткани визуализации, связанной с инфракрасным ультра-короткого импульсного возбуждения ^1, произвела революцию наш взгляд на жизненные процессы на уровне одноклеточного, раскрывая моторику и взаимодействия моделей различных сотовые подмножества в живых животных ^2-5. Тем не менее, современные технологии по-прежнему недостаточно для выяснения механизмов функции органа и дисфункции в качестве предпосылки для разработки новых терапевтических стратегий, так как он оказывает только недостаточной информации о молекулярной основе клеточного ответа в тканях в норме и патологии. Современная технология позволяет только пространственное окно несколько сотен микрон из-за рассеяния и волновые фронты эффекты искажения на пространственное разрешение и отношение сигнал-шум ^6, которые особенно очевидны в очень компактной ткани взрослых животных. Эти рассеяния и волновые эффекты передние искажения обусловлены весьма неоднородной апг анизотропной распределение показателя преломления в ткани, приводит в качестве первого шага на глубину зависимого ухудшения 3D пространственным разрешением и, наконец, к полной потере сигнала, приходящего из баллистических фотонов возбуждения, то есть потери отношением сигнал-шум. С точки зрения bioscientific и приложений биомедицинских глубокой ткани, это означает, что в настоящее время технологии не в состоянии однозначно выявить сотовой связи, потому что плохое разрешение приведет к ложно положительных взаимодействий в то время как снижение отношения сигнал-шум вызовет система выйти на некоторые взаимодействия между тусклыми структур.

Для того, чтобы однозначно обнаружить клеточные взаимодействия в динамике, значительно улучшены пространственное разрешение необходимо глубоко в ткани. В настоящее время введены мощные методы Наноскопия на основе специальных алгоритмов численного, например подходов структура-освещения, на истощение первого возбужденного состояния, например </em> STED, RESOLFT или по локализации молекул, например dSTORM, PALM, нашли множество применений в основной клеток, а также в культурах живых клеток ^7. Тем не менее, для того чтобы расширить эти приложения, чтобы срезах тканей, живой ткани и организмов мы все еще должны преодолеть серьезные технические трудности. Двухфотонное возбуждение STED с различными длинами волн, а также с одной длине волны (sw2PE-STED) возбуждения и стимулированное излучение было применено для улучшения пространственного разрешения в срезах мозга ⁸ или в искусственных матриц с внедренными клеток ^9, соответственно, в то же осевое разрешение в качестве стандартного TPLSM. Использование одного фотона STED, динамика дендритных шипиков могли быть отображены на поверхности коры головного мозга (до 10-15 глубины мкм) в живом Thy1 EGFP мыши с разрешением 67 нм ^10. Универсальный инструмент для биологии развития обеспечивается мультифокальной структурированной подсветки микроскопии, которая обеспечивает двукратное улучшение 2Dразрешение. Однако этот метод может быть использован только в организмах с низкой склонностью рассеяния света, таких как рыба-зебра эмбрионов ^11. Тем не менее, ни один из этих методов не может быть применен в высококвалифицированных рассеяния ткани взрослых животных в несколько сотен микрометров, которые имеют решающее значение модели для биомедицинских и клинических исследованиях заболеваний с начала после рождения.

Независимо от используемого приближения для расчета дифракционной волны форму передней части, то есть функции размытия точки (PSF), после фокусировки через объектив, ширина PSF вдоль оптической оси (резолюция осевая), по крайней мере в три раза больше, чем ширина PSF, перпендикулярной к оптической оси (пространственным разрешением) ^12. Волнового фронта искажения различных порядков количественно коэффициентов Цернике в значительно изменить волнового фронта форму целенаправленной электромагнитной волны в визуализации глубокие ткани, ведущие к гораздо более крупных PSFs, особенно вдоль оптическойаль оси ^13-15. Таким образом, оба законы дифракции и эффекты волнового фронта искажения указывают на разрешение вдоль оптической оси, что и ограничивающим фактором в области обработки изображений глубокие ткани. В то время как Наноскопия методы сосредоточиться на противодействии пределы дифракции только, технология, которая улучшает осевой разрешение и контрастность по противодействию как дифракцию и волнового фронта эффекты искажения необходим для прижизненной визуализации с высоким разрешением. В идеале, эта методика должна быть также достаточно быстро, чтобы позволить контролировать клеточной динамики.

В режиме реального времени коррекция ФСФ аберраций и потери контраста с помощью адаптивной оптики в TPLSM была тщательно изучена и улучшение в последнее десятилетие ^13,14,16-18 и поэтому лучшими в настоящее время выбор ведет к более эффективному управлению баллистической возбуждения фотоны ^14. Тем не менее, в связи с тем, что большинство волнового фронта коррекции подходов, используемых в адаптивной оптики носят итеративный и что они гаве повторить для небольших участков (несколько 10 х 10 мкм ²⁾ в связи с высокой неоднородностью показателя преломления в ткани, скорость приобретения значительно ниже, чем необходимо для визуализации клеточной подвижности и связи. Кроме того, физический предел в адаптивной оптической улучшилось TPLSM по-прежнему определяется дифракции.

Пространственная модуляция освещения (SPIN) и временной модуляции на стороне обнаружения (плоские) были теоретически предлагается применять к лазерной сканирующей микроскопии, чтобы улучшить качество изображения. Их практическое применение в прижизненной визуализации еще предстоит продемонстрировали ^19.

Взятые вместе, существует высокая потребность в разработке технологий, которые улучшают разрешение для глубокие ткани визуализации в живых взрослых животных. В этой работе, мы достигаем пространственной модуляции картины возбуждения контролируя процесс сканирования в многолучевой полосатый-подсветка многофотонное лазер-хконсервирование микроскопии (MB-СИ-MPLSM) ^20. Вопреки структурированных подходов освещения, в которых раздел возбуждения крест луч пространственно-модулированных, мы используем только процесс сканирования для достижения пространственной модуляции возбуждения. Расширяя возбуждение в большей длиной волны, мы можем улучшить и пространственное разрешение и отношение сигнал-шум в глубокой ткани сильно рассеивающих тканей (например, лимфатический узел, путь свободного рассеяния 47 мкм ^6), независимо от оптических нелинейный сигнал мы обнаруживаем, например флуоресценция, генерация второй гармоники или другой частоты смешивания явление. Используя этот подход на длинах волн возбуждения до 900 нм мы можем динамически изображения сотовой белковые структуры в масштабе нескольких молекул в зародышевых центрах мыши лимфатических узлов. Таким образом, мы можем лучше представить себе взаимодействие между антиген проведения единиц на поверхности фолликулярных дендритных клеток и В-клеток в процессе зондирования антиGen в течение иммунного ответа в вторичных лимфоидных органах.