Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), mit seinen Vorteilen für die tiefen Gewebe-Bildgebung mit Infrarotultrakurzpulsanregung ^ein Zusammenhang hat unsere Sicht auf Lebensprozesse auf Einzelzellebene durch die Enthüllung Motilität und Interaktionsmuster der verschiedenen revolutioniert Zell-Untergruppen in lebenden Tieren ^05.02. Allerdings ist aktuelle Technik noch nicht ausreichend, um die Mechanismen der Organfunktion und Dysfunktion als Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu klären, da es nur spärliche Informationen über die molekularen Grundlagen der Zellantwort im Gewebe in Gesundheit und Krankheit macht. Die derzeitige Technologie ermöglicht nur eine räumliche Fenster einige hundert Mikrometer aufgrund von Streuung und Wellenfront-Verzerrungseffekte auf die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis ^6, die in der sehr kompakten Gewebe von erwachsenen Tieren besonders offensichtlich sind. Aufgrund einer sehr heterogenen Diese Streuung und ein Wellenfrontverzerrungseffekte sindd anisotrope Verteilung des Brechungsindex im Gewebe, was in einem ersten Schritt bis zu einer Tiefe abhängige Verschlechterung der 3D-Raumauflösung und schließlich zum völligen Verlust der Signal aus ballistischem Anregungsphotonen, also Verlust des Signal-zu-Rausch-Verhältnis Ursprung. In Bezug auf die biowissenschaftliche und biomedizinische tiefen Gewebe Anwendungen bedeutet dies, dass die aktuelle Technologie ist nicht eindeutig offenbaren zellulären Kommunikation, weil schlechte Auflösung würde zu falsch positiven Wechselwirkungen führen, während die Abnahme des Signal-zu-Rausch-Verhältnis würde dazu führen, das System einige Blick Wechselwirkungen zwischen schwachen Strukturen.

Um die zelluläre Interaktionen eindeutig erkennen dynamische Weise wird eine stark verbesserte räumliche Auflösung tief im Gewebe erforderlich. Die aktuell eingeführte leistungsstarke Nanoskopie Techniken, die auf spezielle numerische Algorithmen, wie zB Struktur-Beleuchtung Ansätze, auf Erschöpfung des ersten angeregten Zustand, z. B. </em> STED, RESOLFT oder auf Molekül-Lokalisierung, zB dSTORM, PALM, haben viele Anwendungen in fixierten Zellen als auch in Live-Zellkulturen ⁷ gefunden. Allerdings, um diese Anwendungen zu Gewebeschnitten, lebendes Gewebe und Organismen erweitern wir müssen noch ernsthafte technische Schwierigkeiten zu überwinden. Zwei-Photonen-Anregung mit unterschiedlichen Wellenlängen als auch mit einer einzigen Wellenlänge (sw2PE-STED) zur Anregung STED und stimulierte Emission wurde angewandt, um die laterale Auflösung in Hirnschnitten ⁸ oder in künstlichen Matrizen verbessern mit eingebetteten Zellen ^9, die jeweils an der gleichen axiale Auflösung als Standard TPLSM. Mit einem STED-Photonen, die Dynamik der dendritischen Dornen konnte an der Oberfläche der Hirnrinde (bis zu 10-15 um Tiefe) in einem lebenden Thy1 EGFP-Maus mit einer Auflösung von 67 nm ¹⁰ abgebildet werden. Ein vielseitiges Werkzeug für Entwicklungsbiologie wird von der multifokalen strukturierten Beleuchtung Mikroskopie, die zwei-fach verbesserte 2D bereitstelltAuflösung. Allerdings kann diese Technik nur in Organismen mit einer geringen Neigung der Lichtstreuung wie Zebrafischembryonen ¹¹ verwendet werden. Dennoch kann keine dieser Techniken in der hoch-streuendem Gewebe erwachsener Tiere in mehreren hundert Mikrometern, die entscheidend Modelle für die biomedizinische Forschung und klinische Erkrankungen bei Einsetzen nach der Geburt angewendet werden.

Unabhängig von der Näherung verwendet, um den beugungsbegrenzten Wellenfrontform zu berechnen, dh die Punktverteilungsfunktion (PSF), nach der Fokussierung durch eine Linse, mindestens dreimal größer ist als die Breite der PSF entlang der optischen Achse (axialer Auflösung) die PSF Breite senkrecht zu der optischen Achse (laterale Auflösung) ^12. Wellenfrontverzerrungen durch verschiedene Aufträge Zernikes Koeffizienten quantifiziert die Wellenfrontform von fokussierten elektromagnetischen Welle in tiefen Gewebe-Bildgebung, die zu viel größeren PSFs, vor allem entlang der optischen erheblich ändernal Achse ^13-15. Daher sind sowohl die Beugungs Gesetze und die Wellenfrontverzerrungseffekte verweisen auf die Auflösung entlang der optischen Achse als limitierender Faktor bei tiefen Gewebe-Bildgebung. Während Nanoskopie-Techniken konzentrieren sich auf entgegen die Grenzen der Beugungs nur, eine Technologie, die axiale Auflösung und Kontrast entgegenwirkt sowohl Beugung und Wellenfront-Verzerrungseffekte verbessert wird zur hochauflösenden Intravital Bildgebung notwendig. Idealerweise sollte diese Technik auch schnell genug, um die Überwachung der zellulären Dynamik zu ermöglichen.

Die Echtzeit-Korrektur von Aberrationen und PSF Kontrastverlust mit Hilfe der adaptiven Optik in TPLSM wurde ausgiebig untersucht und in den letzten zehn Jahren ^13,14,16-18 verbessert und es ist daher die derzeit besten Wahl, die zu einer besseren Verwaltung der ballistischen Erregungs ¹⁴ Photonen. Dennoch, aufgrund der Tatsache, dass die meisten Wellenfrontkorrektur Ansätze in der adaptiven Optik verwendet werden, sind iterative und dass sie have für kleine Flächen (einige 10 x 10 &mgr; m ²⁾ aufgrund der hohen Heterogenität des Brechungsindex in Gewebe wiederholt werden, ist die Erfassungsgeschwindigkeit wesentlich geringer als für die Bildgebung Zellmotilität und Kommunikation erforderlich. Darüber hinaus ist die physikalische Grenze in der adaptiven Optik-TPLSM verbessert wird immer noch von Beugung bestimmt.

Räumliche Modulation der Beleuchtung (SPIN) und zeitliche Modulation auf der Erfassungsseite (SPADE) wurden theoretisch vorgeschlagen, Laser-Scanning-Mikroskopie eingesetzt, um die Auflösung zu verbessern. Ihre praktische Anwendung in der Intravital Bildgebung noch zu ¹⁹ nachgewiesen werden.

Zusammengenommen gibt es eine hohe Nachfrage nach der Entwicklung von Technologien, die die Auflösung für die tiefen Gewebe-Bildgebung in lebenden erwachsenen Tieren zu verbessern. In dieser Arbeit erreichen wir räumliche Modulation des Anregungsmusters durch Steuern der Scan-Vorgang in Mehrstrahl-Beleuchtungsstreifen Multi-Photonen-Laser-sKonservenmikroskopie (MB-SI-MPLSM) ^20. Im Gegensatz zu strukturierten Beleuchtung Ansätze, in denen die Anregungsstrahlquerschnitt räumlich moduliert ist, verwenden wir nur den Scan-Vorgang, um die räumliche Modulation der Anregung zu erreichen. Mit dem Ausbau der Anregung zu einer längeren Wellenlänge, wir sind in der Lage, sowohl die räumliche Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis im tiefen Gewebe von stark streu Gewebe (z. B. Lymphknoten, frei Streupfad 47 um ⁶⁾ zu verbessern, unabhängig von der optischen nichtlineare Signal wir erkennen, z. B. Fluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen oder anderen Frequenzmischphänomen. Unter Verwendung dieses Ansatzes bei Anregungswellenlängen bis zu 900 nm sind wir in der Lage, dynamisch Bild zellulären Proteinstrukturen in der Größenordnung von wenigen Molekülen in Keimzentren der Lymphknoten der Maus. So kann man besser die Interaktion zwischen Antigen tragenden Einheiten auf der Oberfläche der follikulären dendritischen Zellen und B-Zellen sichtbar in dem Verfahren zum Testen des Antigen während der Immunantwort in sekundären lymphatischen Organe.