生发中心的高度已解决活体条纹照明显微镜

双光子激光扫描显微镜（TPLSM），其优点为深层组织成像与红外超短脉冲激发^1，已通过揭示各种运动和交互模式彻底改变了我们的看法在单细胞水平的生命过程细胞亚群在活体动物^2-5。然而，目前的技术仍不足以澄清器官的功能和功能障碍的机制，作为开发新的治疗策略的先决条件，因为它使得大约只有在健康和疾病组织中的细胞反应的分子基础稀疏信息。当前技术使由于散射几百微米只有一个空间窗口和波上的空间分辨率和信号噪声比^6，这是特别明显的成年动物的高度紧凑的组织面前的失真效应。这些散射和波前畸变的影响是由于高度异质的的折射率在组织三维各向异性分布，导致在第一步骤中，以三维空间分辨率的深度依赖性恶化，最后到信号从弹道激发光子， 即损失的信号-噪声比始发的总损耗。在生物科学和生物医学深层组织的应用程序而言，这意味着目前的技术是无法明确地揭示蜂窝通信，因为分辨率差，会导致假阳性的相互作用，而信号噪声比的减少将导致系统忽略了一些暗淡的结构之间的相互作用。

为了清楚地检测以动态方式的细胞相互作用，一个高度改善的空间分辨率，需要深的组织内。基于特殊的数值算法， 如结构照明方式，对第一激发态损耗， 如目前推出了功能强大的纳米显微技术</em>受激发射损耗，RESOLFT，或在分子的定位， 例如 dSTORM，PALM，已经发现许多应用中固定的细胞，以及在活细胞培养^7。然而，为了这些应用程序扩展到组织切片，活组织和有机体，我们仍然需要克服严重的技术困难。双光子激发的受激发射损耗具有不同波长，以及与单个波长（sw2PE-STED），用于激励和受激发射已被应用，以提高横向分辨率在大脑切片⁸或人工基质与包埋细胞^9，分别在同一轴向分辨率为标准TPLSM。利用单光子受激发射损耗，树突棘的动态可以在大脑皮质（长达10-15微米的深度）的表面活Thy1系EGFP小鼠在67纳米¹⁰的分辨率成像。一个多功能的工具，用于发育生物学是由多灶性结构照明显微镜，它提供了两方面的改进二维提供分辨率。然而，这种技术可用于仅在与光散射如斑马鱼胚胎¹¹倾向低的生物。不过，没有这些技术可以在成年动物的高散射组织被应用在数百微米，这是至关重要的模型与发病的疾病在出生后的生物医学和临床研究。

独立用于计算衍射限制的波前的形状， 即该点扩散函数（PSF）的近似值，聚焦通过透镜后，沿着光轴（轴向分辨率）的PSF的宽度大于至少3倍PSF的宽度在垂直于光轴（横向分辨率^）12。波不同的订单面前的扭曲泽尔尼克的量化系数大大修改深层组织成像聚焦电磁波导致更大的PSF，特别是沿光纤的波前形状人轴^13-15。因此，这两个衍射法和波前畸变效应指向沿着光轴在深层组织成像的限制因素的分辨率。而纳米显微技术专注于抵消衍射的极限只有一个技术，提高了轴向分辨率和通过抵消两个衍射和波前畸变效应的对比度是需要高分辨率的活体成像。理想情况下，这种技术应该也足够快，以便监测细胞动力学的。

PSF畸变和使用TPLSM自适应光学对比度损失的实时校正已被广泛研究，并在过去十年^13,14,16-18改善，因此它是目前市面上最好的选择，从而更好地管理弹道导弹激励¹⁴的光子。不过，由于大部分波前校正方法在自适应光学系统中使用的其实是迭代和他们公顷已经被重复为小区域（数10×10微米^2）由于在组织中的折射率的高异质性，采集速度比所需的成像细胞运动和通信显著更低。此外，在自适应光学的物理极限提高TPLSM仍然由衍射确定。

照明（SPIN）和检测侧（铲）时间调制的空间调制已经从理论上提出了要施加到激光扫描显微镜来提高分辨率。在活体成像的实际应用还有待证明^19。

综上所述，对于技术，有效地提高了分辨率为深层组织成像在活成年动物发展的高需求。在这项工作中，我们实现了激励模式的，通过控制在多波束条带照明的多光子激光 – S的扫描过程空间调制罐头镜^{（MB-SI-MPLSM）20。}相反，以结构化的照明方法，其中，所述激发光束的横截面进行空间调制，我们只使用扫描过程来实现激发的空间调制。通过扩大激发到更长的波长，我们是独立的光能够提高在高散射组织（ 如淋巴结，自由散射路径47微米^6）深层组织双方的空间分辨率和信号噪声比，我们检测到的非线性信号， 例如荧光，产生二次谐波或其它混频现象。使用这种方法在激发波长为900毫微米，我们能够动态图像的细胞的蛋白质结构上的几个分子在小鼠淋巴结生发中心的规模。因此，我们可以更好地可视化在探测反过程滤泡树突细胞和B细胞的表面上的抗原携带单元之间的相互作用期间在次级淋巴器官的免疫应答根。