Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi
Summary
Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.
Abstract
Intravital derin doku çoklu foton mikroskobu ile hücresel iletişimi izleme sağlığı ve hastalıkları, kalın doku örneklerinin ve organları içinde bağışıklık hücrelerinin kaderini anlamak için anahtardır. Çoklu foton mikroskopi tarama desenini ve uygun sayısal algoritmaları uygulayarak, biz daha iyi eksenel çözünürlük ve daha gelişmiş sinyal-gürültü oranı, yani kontrast, 3 kat elde etmemizi sağladı ki, bir çizgili-aydınlatma yaklaşım geliştirdi standart çok-foton mikroskopi ile karşılaştırıldığında son derece lenfoid organların doku saçılma içinde 100 mikron doku derinliği. Görüntüleme derinlik nedeniyle alan detektörlerinin kullanılması ile biraz daha düşük iken, toplama hızı hem de ışıkla ağartma ve fotohasar etkileri, standart foto çoğaltıcı dayalı tekniğe benzer. Çizgili-aydınlatma yaklaşımı kullanarak, ikincil foliküler dendritik hücreler üzerinde immün kompleks mevduat dinamiklerini gözlemlemek mümkün ̵1; germinal merkezlerinde bir kaç protein molekülünün bir seviyede.
Introduction
İki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), kızılötesi ultra kısa atımlı uyarma 1 ilgili derin doku görüntüleme için avantajları ile çeşitli motilite ve etkileşim kalıplarını ortaya koyarak bir tek hücre düzeyinde hayati süreçleri hakkındaki görüşümüzü devrim yarattı hayvanların 2-5 yaşayan hücre alt. Ancak, mevcut teknoloji, sağlık ve hastalık dokuları içinde hücresel yanıtın moleküler temeli hakkında sadece seyrek bilgiler vermektedir beri, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için bir ön koşul olarak organ fonksiyonu ve disfonksiyonu mekanizmaları aydınlatmak için hala yetersizdir. Mevcut teknoloji saçılma nedeniyle birkaç yüz mikron sadece bir mekansal pencere açar ve mekansal çözünürlükte ve yetişkin hayvanların son derece kompakt dokusunda özellikle ortada sinyal-gürültü oranı 6, üzerinde ön distorsiyon etkileri dalga. Bu saçılma ve dalga ön distorsiyon etkileri oldukça heterojen An nedeniyle3 boyutlu uzamsal çözünürlük bir derinliğe bağlı bozulması için bir birinci aşamada dokularda kırılma indeksi d anizotropik dağıtım ve son balistik uyarılma fotonlarının, sinyal-gürültü oranı yani kaybından kaynaklanan sinyalin toplam kaybına bağlanmıştır. Bioscientific ve biyomedikal derin doku uygulamaları açısından, bu sinyal-gürültü oranının azalması sistemi bazı ardı neden olur oysa düşük çözünürlük yalancı pozitif etkileşimlerin yol açacak, çünkü mevcut teknoloji tümden hücresel iletişimi ortaya çıkarmak için mümkün olduğu anlamına gelir Loş yapılar arasındaki etkileşimler.
Net bir şekilde dinamik bir şekilde hücresel etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük derin doku içinde gereklidir. Örneğin özel sayısal algoritmalar, ilk uyarılmış durum incelmesi örneğin yapısı-aydınlatma yaklaşımlar, dayalı anda tanıtıldı güçlü nanoscopy teknikleri </em> STED'in, RESOLFT veya molekül yerinin üzerinde, örneğin dSTORM, PALM, sabit hücrelerin yanı sıra canlı hücre kültürlerinde 7'de birçok uygulama bulduk. Ancak, doku bölümleri, canlı doku ve organizmalar için bu uygulamaları genişletmek için biz hala ciddi teknik zorlukların üstesinden gelmek gerekir. İki foton uyarma farklı dalga boylarına sahip hem de uyarma için, tek bir dalga boyunda (sw2PE-STED) ile STED ve emisyon aynı anda sırasıyla gömülü hücrelerin 9, beyin dilimleri 8 ya da yapay matrislerde yanal çözünürlüğünü geliştirmek için uygulanmış uyarılmış standart TPLSM olarak eksenel çözünürlük. Tek-foton STED'i kullanarak, dendritik dikenler dinamikleri 67 nm 10 çözünürlükte bir yaşam Thy1 EGFP fare beyin korteksinin (kadar 10-15 mikron derinlik) yüzeyinde görüntülü olabilir. Gelişimsel biyoloji için çok yönlü bir araç iki kat geliştirilmiş 2D sağlayan multifokal yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu tarafından sağlanmaktadırçözünürlük. Ancak, bu teknik sadece bu zebra balığı embriyolar 11 gibi ışık saçılması düşük bir eğilimi olan organizmalar kullanılabilir. Yine de, bu tekniklerin hiçbiri, doğum sonrası başlangıçlı hastalıkların biyomedikal ve klinik araştırmalar için önemli bir model olan birkaç yüz mikrometre arasında, yetişkin hayvanların yüksek saçılma dokusunda uygulanabilir.
Nokta dağılım fonksiyonu (PSF), yani kırınım-sınırlı dalga ön şeklini hesaplamak için kullanılan yaklaşım, bağımsız, bir lens aracılığıyla odaklama sonra, optik eksen (eksenel çözünürlük) boyunca PSF genişliği en az üç kat daha büyük Optik eksenin (lateral çözünürlük) 12 dik PSF genişliği. Önemli ölçüde özellikle optik boyunca çok daha büyük PSFs, önde gelen derin doku görüntülemede odaklı elektromanyetik dalga dalga ön şekli değiştirmek Zernike katsayıları ile ölçülebilir farklı siparişlerin ön bozulmaları dalgadiğerleri 13-15 eksen. Bu nedenle, kırılma kanunları ve dalga ön bozulma etkileri hem derin doku görüntülemede sınırlayıcı faktör olarak optik eksen boyunca çözünürlüğe işaret. Nanoscopy teknikleri kırınım sınırlarını mücadele odaklanmak Oysa sadece eksenel çözünürlük ve kırılması ve dalga-ön bozulma etkileri hem mücadele ile kontrastı artıran bir teknoloji, yüksek-çözünürlüklü Intravital görüntüleme için gereklidir. İdeal olarak, bu tekniğin yeterince hızlı hücresel dinamikleri izlenmesini sağlamak için de olmalıdır.
PSF sapmaları ve TPLSM uyarlanabilir optik kullanarak kontrast kaybı gerçek-zamanlı düzeltme yoğun çalışılan ve son on yılda 13,14,16-18 geliştirilmiş ve bu nedenle balistik uyarma daha iyi bir yönetime giden anki mevcut en iyi seçimdir olmuştur 14 fotonlar. Yine nedeniyle en ön düzeltme adaptif optik kullanılan yaklaşımlar dalga gerçeği iteratif ve onlar ha vardırnedeniyle dokuda kırılma indeksi yüksek heterojen küçük alanlar için (birkaç 10 x 10 mikron 2) tekrarlanmasını ettik, toplama hızı görüntüleme hücre motilitesi ve iletişim için gerekli önemli ölçüde daha düşüktür. Ayrıca, adaptif-optik olarak fiziksel sınır TPLSM yine kırınımı ile belirlenir geliştirilmiş.
Aydınlatma (SPIN) ve algılama tarafında (SPADE) temporal modülasyon Mekansal modülasyonu teorik çözünürlüğü artırmak için lazer tarama mikroskopisi için uygulanacak önerilmiştir. Intravital görüntülemede pratik uygulama hala 19 gösterilmelidir kalır.
Birlikte ele alındığında, yetişkin hayvanların canlı derin doku görüntüleme için çözünürlüğünü artırmak teknolojilerin gelişimi için yüksek bir talep var. Bu çalışmada, çoklu ışın çizgili-aydınlatma çoklu foton lazer-s tarama işlemini kontrol ederek uyarma desen mekansal modülasyon eldekonserve mikroskobu (MB-SI-MPLSM) 20. Uyarım kiriş kesiti uzaysal modüle edildiği yapılandırılmış aydınlatma yaklaşımlar, aksine, biz uyarma uzaysal modülasyonunu elde etmek için sadece tarama işlemini kullanır. Uzun dalga boyuna uyarım genişleterek, biz bağımsız optik, yüksek doku (örneğin lenf düğümü, serbest-saçılım yolu 47 mikron 6) saçılma derin doku mekansal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranını hem de geliştirmek mümkün biz tespit non-lineer bir sinyal, örneğin floresan, ikinci harmonik üretimi veya diğer frekans fenomen karıştırma. 900 nm eksitasyon dalga boyu kadar bu yaklaşımı kullanarak fare lenf nodu germinal merkezlerinde az molekül ölçeğinde dinamik görüntü hücresel protein yapıları edebiliyoruz. Bu nedenle, daha iyi bir anti tarama işleminde foliküler dendritik hücreler ve B hücrelerinin yüzeyi üzerinde antijen taşıyan birimleri arasındaki etkileşimin görselleştirmekikincil lenfoid organlarda immün yanıtı sırasında gen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravital optik görüntüleme amacı dinamik ve fonksiyonel doku ve sağlık ve hastalık 5 organ işlevini anlamak amacıyla hücresel hareketliliğini ve etkileşimleri görselleştirmek için. Bu, çoklu foton lazer tarama mikroskobu elde etmek için en güçlü teknoloji, hala, onun uzaysal çözünürlüğü sınırlamak ön çarpıtmalar, saçılması, yavaş edinimi, ışıkla ve fotohasar, dalga ilişkin sınırlamaları aşmak kontrast yanı sıra zaman çözünürlüğü vardır .
<p class="jo…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz C57BL / 6 B1-8 GFP transgenik fareler sağlamak için çizgili-aydınlatma yaklaşımı, K. ve A. Rajewsky Haberman'da gelişimi sırasında verimli tartışmalar için R. Heintzmann teşekkür ederim. Biz mali destek için Deutsche hibe NI1167/3-1 altında Forschungsgemeinschaft (RN), HA5354/4-1 ve SFB633, proje A15 (AEH için), hibe Rahel-Hirsch burs kapsamında Charite (RN) kabul. Biz özellikle verimli tartışmalar ve altyapı desteği için ağ Jimi kabul
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
Referências
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation – stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. . Advanced optical imaging. , (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
