कीटाणु केन्द्रों की अत्यधिक हल intravital धारीदार रोशनी माइक्रोस्कोपी
Summary
वयस्क चूहों के लिम्फ नोड्स में 120 मीटर गहराई तक बढ़ाया विपरीत के साथ उच्च संकल्प intravital इमेजिंग स्थानिक एक बहु – फोकल दो photon माइक्रोस्कोप की उत्तेजना पैटर्न modulating द्वारा हासिल की है. 100 मीटर गहराई में हम इस तरह बिखरने और विवर्तन सीमा circumventing, 487 एनएम का संकल्प (पार्श्व) और 551 एनएम (अक्षीय) मापा.
Abstract
Intravital गहरे ऊतक बहु photon माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर संचार की निगरानी के लिए स्वास्थ्य और रोग में मोटी ऊतकों के नमूनों और अंगों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भाग्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. बहु photon माइक्रोस्कोपी में स्कैनिंग पैटर्न को नियंत्रित करने और उपयुक्त संख्यात्मक एल्गोरिदम को लागू करके, हम बेहतर अक्षीय संकल्प और अधिक से अधिक में सुधार के संकेत से शोर अनुपात, यानी इसके विपरीत, 3 गुना हासिल करने के लिए हमें सक्षम है, जो एक धारीदार रोशनी दृष्टिकोण विकसित मानक बहु photon माइक्रोस्कोपी की तुलना में अत्यधिक lymphoid अंगों के ऊतक बिखरने के भीतर 100 माइक्रोन ऊतक गहराई. इमेजिंग गहराई के कारण क्षेत्र का पता लगाने का उपयोग करने के लिए थोड़ा कम था जबकि अधिग्रहण की गति के साथ ही photobleaching और photodamage प्रभाव, मानक फोटो गुणक आधारित तकनीक के समान थे. धारीदार रोशनी दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम माध्यमिक कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं पर प्रतिरक्षा जटिल जमा की गतिशीलता का पालन करने में सक्षम हैं ̵1; कीटाणु केन्द्रों में कुछ प्रोटीन अणुओं के स्तर पर.
Introduction
दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM), अवरक्त अति लघु स्पंदित उत्तेजना 1 से संबंधित गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए अपने फायदे के साथ, विभिन्न की गतिशीलता और बातचीत के पैटर्न का खुलासा द्वारा एक एकल कोशिका स्तर पर महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं पर हमारे विचार क्रांति ला दी है जानवरों 2-5 जीने में सेल सबसेट. हालांकि, मौजूदा प्रौद्योगिकी यह स्वास्थ्य और रोग में ऊतकों के भीतर सेलुलर प्रतिक्रिया के आणविक आधार के बारे में केवल विरल जानकारी renders के बाद, नए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक शर्त के रूप में अंग समारोह और रोग के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए अभी भी अपर्याप्त है. वर्तमान प्रौद्योगिकी बिखरने की वजह से कुछ सौ माइक्रोन का केवल एक स्थानिक विंडो में सक्षम बनाता है और स्थानिक संकल्प और वयस्क पशुओं की अत्यधिक कॉम्पैक्ट ऊतक में विशेष रूप से स्पष्ट कर रहे हैं, जो संकेत करने वाली शोर अनुपात 6, पर सामने विरूपण प्रभाव लहर. ये बिखरने और लहर सामने विरूपण प्रभाव एक अत्यंत विषम एक की वजह से कर रहे हैं3 डी स्थानिक संकल्प की गहराई निर्भर गिरावट के लिए एक पहला कदम में प्रमुख ऊतक में अपवर्तनांक के डी anisotropic वितरण, और अंत में बैलिस्टिक उत्तेजना फोटॉनों, संकेत करने वाली शोर अनुपात यानी नुकसान से होने वाले संकेत के कुल नुकसान के लिए. Bioscientific और जैव चिकित्सा गहरी ऊतक अनुप्रयोगों के संदर्भ में, यह संकेत करने वाली शोर अनुपात की कमी प्रणाली कुछ अनदेखी करने के कारण होता है, जबकि गरीब संकल्प झूठा सकारात्मक बातचीत के लिए नेतृत्व करेंगे क्योंकि मौजूदा प्रौद्योगिकी स्पष्ट सेलुलर संचार प्रकट करने में असमर्थ है कि इसका मतलब है मंद संरचनाओं के बीच बातचीत.
स्पष्ट एक गतिशील रास्ते में सेलुलर बातचीत का पता लगाने के लिए आदेश में, एक अत्यधिक सुधार स्थानिक संकल्प गहरी ऊतक के भीतर की जरूरत है. जैसे विशेष संख्यात्मक एल्गोरिदम, पहली उत्साहित राज्य की कमी पर जैसे संरचना रोशनी दृष्टिकोण के आधार पर, वर्तमान में पेश शक्तिशाली nanoscopy तकनीक </em> STED, RESOLFT, या अणु स्थानीयकरण पर, जैसे dSTORM, पाम, तय कोशिकाओं में साथ ही रहते सेल संस्कृतियों 7 में कई आवेदन मिल गया है. हालांकि, ऊतक वर्गों, रहने वाले ऊतक और जीवों के लिए इन आवेदनों का विस्तार करने के लिए हमें अभी भी गंभीर तकनीकी कठिनाइयों को दूर करने की जरूरत है. दो photon उत्तेजना अलग तरंग दैर्ध्य के साथ के साथ ही उत्तेजना के लिए एक एकल तरंगदैर्ध्य (sw2PE-STED) के साथ sted और उत्सर्जन उसी में क्रमश: एम्बेडेड कोशिकाओं 9, साथ मस्तिष्क स्लाइसें 8 में या कृत्रिम matrices में पार्श्व संकल्प में सुधार करने के लिए लागू किया गया है प्रेरित मानक TPLSM रूप अक्षीय संकल्प. एक फोटान STED का उपयोग करना, वृक्ष के समान spines की गतिशीलता 67 एनएम 10 के एक प्रस्ताव पर रहने वाले एक Thy1 EGFP माउस में मस्तिष्क प्रांतस्था (अप करने के लिए 10-15 माइक्रोन गहराई) की सतह पर imaged किया जा सकता है. विकास जीव विज्ञान के लिए एक बहुमुखी उपकरण दो गुना सुधार 2D प्रदान करता है जो Multifocal संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई हैसंकल्प. हालांकि, इस तकनीक ही ऐसी ज़ेबरा मछली भ्रूण के रूप में 11 प्रकाश बिखरने का एक कम प्रवृत्ति के साथ जीवों में इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, इन तकनीकों में से कोई भी जन्म के बाद शुरू होने के साथ बीमारियों की जैव चिकित्सा और नैदानिक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण मॉडल हैं जो micrometers के कई सैकड़ों, में वयस्क पशुओं की अत्यधिक बिखरने के ऊतकों में लागू किया जा सकता है.
बात फैल समारोह (पीएसएफ) यानी, विवर्तन सीमित लहर सामने आकार की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया सन्निकटन के स्वतंत्र, एक लेंस के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने के बाद, ऑप्टिकल अक्ष (अक्षीय संकल्प) के साथ पीएसएफ की चौड़ाई से कम से कम तीन गुना बड़ा है ऑप्टिकल अक्ष (पार्श्व संकल्प) 12 को सीधा पीएसएफ चौड़ाई. काफी विशेष रूप से ऑप्टिक साथ बहुत बड़ा PSFs, के लिए अग्रणी गहरे ऊतक इमेजिंग में केंद्रित विद्युत चुम्बकीय तरंग की लहर सामने आकार को संशोधित Zernike के गुणांक द्वारा मात्रा अलग आदेशों के सामने विकृतियों वेवअल 13-15 अक्ष. इसलिए, विवर्तन कानूनों और लहर सामने विरूपण प्रभाव दोनों गहरे ऊतक इमेजिंग में सीमित कारक के रूप में ऑप्टिकल अक्ष के साथ संकल्प को इंगित करें. Nanoscopy तकनीक विवर्तन की सीमाओं का प्रतिकार करने पर ध्यान केंद्रित जबकि केवल अक्षीय संकल्प और विवर्तन और लहर सामने विरूपण प्रभाव दोनों का प्रतिकार द्वारा इसके विपरीत में सुधार एक तकनीक है जो उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के लिए आवश्यक है. आदर्श रूप में, इस तकनीक को काफी तेजी से सेलुलर गतिशीलता की निगरानी की अनुमति के लिए भी होना चाहिए.
पीएसएफ aberrations और TPLSM में अनुकूली प्रकाशिकी का उपयोग विपरीत नुकसान की वास्तविक समय सुधार बड़े पैमाने पर अध्ययन और पिछले एक दशक 13,14,16-18 में सुधार हुआ है और यह इसलिए बैलिस्टिक उत्तेजना का एक बेहतर प्रबंधन के लिए अग्रणी सबसे अच्छा वर्तमान में उपलब्ध विकल्प है किया गया है 14 photons. फिर भी, कारण अधिकांश सामने सुधार अनुकूली प्रकाशिकी में इस्तेमाल किया दृष्टिकोण लहर तथ्य यह है कि चलने और वे हा कि कर रहे हैंकारण ऊतकों में अपवर्तनांक के उच्च विविधता के छोटे क्षेत्रों के लिए (कुछ 10 x 10 माइक्रोन 2) दोहराया जा ve, अधिग्रहण गति इमेजिंग सेल गतिशीलता और संचार के लिए आवश्यकता से काफी कम है. इसके अलावा, अनुकूली प्रकाशिकी में शारीरिक सीमा TPLSM अभी भी विवर्तन द्वारा निर्धारित किया जाता है सुधार हुआ.
रोशनी (स्पिन) और पहचान पक्ष (कुदाल) पर अस्थायी मॉडुलन के स्थानिक मॉडुलन सैद्धांतिक रूप से संकल्प में सुधार करने के लिए लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किए जाने का प्रस्ताव किया गया है. Intravital इमेजिंग में उनके व्यावहारिक आवेदन अभी भी 19 का प्रदर्शन किया जाना बना रहता है.
साथ में ले ली, वयस्क रहने वाले जानवरों में गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए बेहतर समाधान जो प्रौद्योगिकियों के विकास के लिए एक उच्च मांग है. इस काम में, हम बहु – किरण धारीदार रोशनी बहु फोटॉन लेजर-S में स्कैनिंग की प्रक्रिया को नियंत्रित करने से उत्तेजना पैटर्न के स्थानिक मॉडुलन प्राप्तकैनिंग माइक्रोस्कोपी (MB-सी-MPLSM) 20. उत्तेजना किरण पार अनुभाग स्थानिक संग्राहक है जिसमें संरचित रोशनी दृष्टिकोण के विपरीत, हम उत्तेजना के स्थानिक मॉडुलन प्राप्त करने के लिए केवल स्कैनिंग प्रक्रिया का उपयोग करें. एक लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य को उत्तेजना के विस्तार से, हम स्वतंत्र रूप से ऑप्टिकल की, अत्यधिक ऊतक (जैसे लिम्फ नोड, मुफ्त बिखरने पथ 47 माइक्रोन 6) बिखरने के गहरे ऊतकों में स्थानिक संकल्प और संकेत करने वाली शोर अनुपात दोनों में सुधार करने में सक्षम हैं हम पता लगाने के लिए गैर रेखीय संकेत, जैसे प्रतिदीप्ति, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी या अन्य आवृत्ति घटना मिश्रण. 900 एनएम के लिए ऊपर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में इस दृष्टिकोण का उपयोग हम माउस लिम्फ नोड्स के कीटाणु केन्द्रों में कुछ अणुओं के पैमाने पर गतिशील रूप से छवि सेलुलर प्रोटीन संरचनाओं करने में सक्षम हैं. इस प्रकार, हम बेहतर विरोधी जांच की प्रक्रिया में कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की सतह पर प्रतिजन ले जाने इकाइयों के बीच बातचीत कल्पना कर सकते हैंमाध्यमिक lymphoid अंगों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान जन.
Protocol
Representative Results
Discussion
intravital ऑप्टिकल इमेजिंग के उद्देश्य को गतिशील और कार्यात्मक ऊतक और स्वास्थ्य और रोग 5 में अंग समारोह को समझने के क्रम में सेलुलर गतिशीलता और बातचीत करने के लिए कल्पना है. यह बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम C57BL 6 / बी 1-8 GFP ट्रांसजेनिक चूहों को उपलब्ध कराने के लिए धारीदार रोशनी दृष्टिकोण, लालकृष्ण Rajewsky और ए Haberman के विकास के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए आर Heintzmann धन्यवाद. हम वित्तीय समर्थन के लिए ड्यूश अनुदान NI1167/3-1 तहत Forschungsgemeinschaft (आर एन के लिए), HA5354/4-1 और SFB633, परियोजना A15 (AEH के लिए), अनुदान Rahel-Hirsch फैलोशिप के तहत चरित (आर एन) के लिए स्वीकार करते हैं. हम विशेष रूप से उपयोगी बातचीत और ढांचागत सहायता के लिए नेटवर्क जिमी स्वीकार
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
Referências
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