I denna artikel presenteras ett protokoll för en kontextuell och cued rädsla konditione test med en videoanalyssystem för att utvärdera rädsla inlärning och minne hos möss.
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är en av de beteendetester som bedömer förmågan hos möss att lära sig och komma ihåg ett samband mellan miljö-stickrepliker och aversiva upplevelser. I detta test är möss placerades i en konditioneringskammare och ges avklipp av en konditionerad stimulus (en auditiv cue) och en aversiv obetingat stimulus (en elektrisk fotchock). Efter en fördröjningstid mössen utsätts för samma konditioneringskammare och en annorlunda formad kammare med presentationen av den auditiva cue. Frysning beteende under testet mäts som ett index av rädsla minne. För att automatiskt analysera beteendet, har vi utvecklat en videoanalyssystem använder ImageFZ programvara programmet, som är tillgänglig som en gratis nedladdning på http://www.mouse-phenotype.org/. Här, för att visa detaljerna i våra protokoll, visar vi vårt förfarande för kontextuella och cued rädsla konditione test i C57BL/6J-möss använder ImageFZ system. Dessutom validerade vi våra protokoll och videon analyserande systemets prestanda genom att jämföra Frystiden mäts av ImageFZ system eller ett system dator mätning photobeam baserade med som görs av en mänsklig observatör. Såsom visas i våra representativa resultat, de data som erhålls genom ImageFZ liknade de som analyseras av en mänsklig observatör, vilket indikerar att beteendeanalys med användning av ImageFZ systemet är mycket tillförlitlig. Den nuvarande film artikel ger detaljerad information om testförfaranden och främja förståelsen för den experimentella situationen.
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är den beteendemässiga paradigm som används för att bedöma associativ rädsla inlärning och minne hos gnagare 1-3. Detta test har i stor utsträckning använts för att förstå de neurobiologiska mekanismer för rädsla inlärning och minne i transgena och knockout-möss 1,4-16. Frysning beteende, som definieras som fullständig orörlighet med undantag för andningen, är en vanlig reaktion på skrämmande situationer. I detta beteende paradigm, efter djuren utsätts för en ihopkoppling av en auditiv kö med en elektrisk footshock, de svarar på rädslan producerande stimulans genom att visa frysning beteende, vilket mäts som ett index på associativ rädsla inlärning och minne. Detta test kräver mindre utarbeta utrustning, mindre fysisk ansträngning av försöksledaren, och mycket mindre träningstid för möss än andra inlärnings-och minnesuppgifter, det i allmänhet kräver ca 5-10 min / dag per mus i 2 dagar. Även om testproceduren är simple och kräver lite tid att utföra, skall utredaren noggrant observera och mäta mus beteende, och därför har flera automatiska mätsystem utvecklats för att genomföra beteendeanalys 17-20. Vår video-analyssystem, som vi utvecklat med ImageFZ programvara, ger oss möjlighet att enkelt analysera frysbeteende och producerar mycket tillförlitliga resultat. Den här artikeln innehåller detaljerad information om vårt testförfarande och beskriver hur du använder ImageFZ programvara.
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är en av de mest använda paradigm för att utvärdera inlärning och minne. Detta test är en form av Pavlovsk beting där en association görs mellan en kontext och / eller en betingad stimulus (auditiv cue) och en aversiv stimulus (elektrisk fotchock). Efter en enda parning av sammanhanget / hörsel cue och footshock, möss uppvisar långvarig frysning när man står inför antingen sammanhanget eller kön. I detta test är frysning beteende används som ett index på rädsla minne. Farmakologiska och lesion studier har visat att minnesbildning, konsolidering, och hämtning regleras i flera delar av hjärnan, som amygdala, hippocampus, och prefrontala cortex 3,33-35. Dessutom har molekylära genetik studier visat betydelsen av specifika gener och molekyler som är involverade i inlärning och minne i dessa områden i hjärnan med hjälp av genmanipulerade möss 36. Därför är detta test enkee och användbar för att utforska den neurobiologiska grunden underliggande rädsla inlärning och minne. I den här filmen artikeln, introducerade vi våra protokoll för att förse praktiker med detaljerad information för att förstå och lätt att genomföra testet.
Frysning beteende kvantifierades genom direkt observation av mänskliga praktiker. En vältränad försöks förväntas ge tillförlitliga och stabila resultat över observationer. Dock innebär den här metoden potentiella problem, som till exempel skillnader i observationsmetoden, observatörs fördomar och enkla kvantifiering misstag, vilket gör det svårt att direkt jämföra resultaten från oberoende praktiker och olika laboratorier. Ett automatiskt system dator mätning photobeam baserade har också använts 26,30-32. Men detta system innebär också potentiella problem i att mäta frysning beteenden. På grund av sensorarrangemanget, kan detta system inte kan upptäcka små huvudrörelser som skulle Typically görs som "aktiv" genom mänsklig observation. Dessutom darr under frysning kan betraktas som nonfreezing eftersom när ett djur fryser, intermittenta avbrott i photobeam observeras som en följd av skakningar. Som en alternativ metod, har automatiserade bild-och videoanalyssystem utvecklats 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 beskrivs några system med bildanalys programvara som har god validitet och göra mål fryser väl 17,20,37-38. Men de flesta av dessa system och analysprogram måste erhållas från kommersiella leverantörer och är vanligtvis kostsamma. Vi utvecklade den ImageFZ programvara för analys av frys beteende, och detta program distribueras som fri programvara. ImageFZ känner av musen som en samling bildpunkter (en partikel) och diskriminerar subtila musrörelser som "fryser" eller "icke-fryser", beroende på mängdenområde nonoverlapping regioner mellan partiklar av varje par av bilder i följd. Såsom visas i de representativa resultat, mätningar med ImageFZ programmet överensstämmer med eller mer exakt än som erhålls med användning av andra metoder. Således mäter ImageFZ programmet automatiskt det beteende som observatörer bedömer som frysning med hjälp av definierade kriterier. Dessutom beräknar ImageFZ programmet den sträcka (cm) före, under och efter footshock exponering, underlätta en bedömning av stötkänslighet och analys av den frysning beteende.
Metodologiska skillnader mellan laboratorierna. Dessa skillnader kan leda till svårigheter att jämföra data mellan laboratorier och replikera resultat i olika laboratorier. För att få mer stabila och jämförbara uppgifter, är det nödvändigt att standardisera testprotokollet så mycket som möjligt. Analyssystem med ImageFZ leder till automatisering av testprocedurer, som kan bidra tillstandardisering av protokoll som används över laboratorier.
Flera beteendemässiga svar måste beaktas när man analyserar frysning beteende. Först när djuren står inför en fruktansvärd situation, kan de fly istället för att frysa 39. Flyr är ett av rädslan svar och dess förekomst kommer att leda till en underskattning rädsla minne. För det andra, kan frysning bero på en allmän aktivitetsnivå, och aktivitetsnivån i försöks-och kontrollmöss måste undersökas. Till exempel, även möss som saknar M1 muskarinacetylkolinreceptorn visade sänkta nivåer av frysning jämfört med vildtyp möss, olika beteendetester indikerade att resultaten kan tillskrivas deras hyperaktivitet fenotyp istället för deras minne nedskrivningar 18. ImageFZ beräknar avståndet (cm) rest av försökspersonerna. Uppgifterna finns tillgängliga för att undersöka om det finns skillnader i de allmänna aktivitetsnivå mellan ämnen. Om det finns en grupp skillnad itillryggalagd sträcka, en möjlig lösning på problemet är att betrakta den sträcka under den första 2 min utbildning som baslinje aktivitet och att använda en dämpning ratio (suppression ratio = (aktivitet under testet) / (aktivitet under baslinjen + aktivitet under provning)) som en sekundär index på rädsla 17,40. Slutligen kan en skillnad i smärtkänslighet, vilket inducerar förändringar i reaktivitet till en elektrisk fotchock, om någon, resultera i variationer i frysbeteendet. ImageFZ beräknar också den sträcka (cm) i detalj från 2 sekunder innan en exponering av en 2 sek fotchock till 2 sekunder efter exponeringen (för 6 sek), som kan användas som ett index på footshock känslighet.
Video-analyssystem har utvecklats för att mäta frys beteende albino, svart, agouti, och späd bruna möss. ImageFZ använder en svart golv bricka och svarta galler för att undersöka vita möss (se Figur 1B). De svarta Gallren är tillverkade av speci ally bearbetade metaller med belagt svart färg och har en elektrisk ledningsförmåga som liknar den i de noncoated metallgaller, vilka typiskt används för svarta möss. ImageFZ analyserar också frysning beteende hos råttor och andra gnagare genom justeringar av programparametrarna. I den aktuella versionen av ImageFZ är beteendet hos ämnet registrerades med användning av en videokamera från den övre väggen för att analysera frysning. ImageFZ skulle också kunna användas i en installation där bilderna är tagna från sidan av kammaren. Dessutom ImageFZ styr maximalt fyra anordningar. Denna funktion gör att forskare att samtidigt undersöka 4 möss, vilket sparar tid och minskar den potentiella påverkan från skillnader i den tid det tar för varje ämne och test ordning på beteendet. Således ImageFZ förenklar testproceduren och analys av frys beteende, och detta program underlättar testning med mindre arbete och utan någon utbildning för de beteendemässiga experiment.
e_content "> I Miyakawa labbet, har vi bedömt mer än 110 stammar av genetiskt modifierade möss och vildtyp kontroll möss i den kontextuella och cued rädsla konditione testet med hjälp av videoanalyssystem för att belysa effekterna av en viss gen på inlärning och minne 41-42 Vi har fått en stor mängd rådata för mer än 5000 möss Den rådata som användes för publicerade forskningsartiklar 4-16 ingår i "Mus Fenotyp Database" som en offentlig databas (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Denna film artikel ger detaljerad information om detaljerna i vår experimentella förfarandet och främjar förståelsen av diskrimineringstester.The authors have nothing to disclose.
En del av de som uppges här erhölls i laboratoriet av Dr Jacqueline N. Crawley i US National Institute of Mental Health och vi vill tacka henne för att tillåta oss att visa data i tidningen. Vi tackar också Kazuo Nakanishi för hans hjälp med att utveckla ImageFZ program för beteendeanalys. Denna forskning stöds av Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning (B) (21.300.121), Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden (Comprehensive Brain Science Network) från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport och kultur i Japan , bevilja från Neuroinformatics Japan Center (NIJC), och bidrag från CREST av Japan Science and Technology Agency (JST).
ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |