マウスにおけるビデオ解析システムを用いた文脈と手掛り恐怖条件付け試験

実験はすべて、地元の動物管理使用委員会によって設立され指導やプロトコルに応じて行われるべきである。 1。装置の設定コンディショニングおよびコンテキスト試験するための装置は、帯電可能格子床を有する正方形室、音源、および較正ショック発生器である。様々なチャンバーサイズは54センチメートルX 27センチメートル×30センチメートル21〜25センチメートルX 35センチメートルX 30センチメートル22まで変化する寸法で、使用されている。このプロトコルでは、装置はアクリルの正方形室で構成されています（33センチ×25センチメートル×28センチメートル、前後壁透明、側壁白）金属グリッド付（0.2cmの直径、離れて0.5cmに間隔）カバー透明なアクリル蓋（ 図1A）で。それは、黒アグーチ、あるいは希薄な茶色のマウスの行動を解析するためにホワイトアクリル床（ 図1B）に室を配置する必要があるので、私に画像解析システム（無料でダウンロードでき、材料/試薬の表を参照）mageFZソフトウェアプログラムは、それぞれの撮影したビデオ画像内の白い背景の暗い被写体を区別します。アルビノマウスはまた、ブラックメタルグリッド、黒色アクリル床（ 図1B）を用いて試験することができる。発光ダイオード（LED）が点灯し、装置上の天井に取り付けられている。格子床は、LEDライトで100ルクスで点灯している。白色雑音/音源（ 図1C）に接続されたスピーカ5センチメートル条件刺激（CS）と、聴覚信号（ホワイトノイズ55 dB）を提示する蓋上の天井に取り付けられている。グリッドを無条件刺激（米国）などの電気フットショックを配信するために、衝撃発生装置（ 図1C）に配線されている。試験室は、試験中に外部からのノイズを最小限に抑えるために防音室（168センチメートル×210センチメートル×200センチ）（ 図1D）内に配置される。この状態は、現在に供されていないマウスを防ぎ聴覚信号または試験マウスの発声を聞くことからテスト。 手がかり試験するための装置が新たなコンテキストを提供する、調整チャンバーとは異なる特性を有するチャンバで構成されている。これは、マウスが調整チャンバとは無関係であるとして新規なコンテキストを知覚するように、できるだけ知覚合図を変更することが肝要である。一般的に、異なる形状のボックスや三角室が使用されます。さらに、異なる照明および/または嗅覚は、マウスに供給される。このプロトコルでは、装置はアクリル三角室である（33センチ×29センチメートル×32センチメートル、それぞれの側壁に白）フラット、白の床、黒アグーチ、またはアルビノ茶色マウスやフラット、黒い床を希釈するためのマウス、透明なアクリルの蓋（ 図1E）で覆われた。 LEDライトは、装置上の天井に取り付けられている。床の照明​​レベルを30ルクスに設定されている。スピーカーはPRに5センチメートル蓋の上の天井に取り付けられているコンディショニングの時点でマウスに与えたものと同じである聴覚合図をESENT。三角形のチャンバは、コンディショニングおよびコンテキスト試験を行っている部屋とは別の防音室に配置されている。 各チャンバは、マウスの挙動を監視するためのクワッドビデオスプリッタとUSB画像キャプチャ装置を介してWindowsコンピュータに接続する天井用電荷結合素子（CCD）カメラを備えている、装置及びマウスの画像がによって捕捉され、分析されるアプリケーションソフトウェアプログラムはImageFZ（プロトコル6を参照）。ホワイトノイズとフットショックジェネレータは自動的にImageFZソフトウェアプログラムによって制御され、開始時刻とホワイトノイズやフットショックの持続期間はのためのビデオに示すサンプルのテキストフ​​ァイル '単純COND」を参照してください（テキストフ​​ァイルに記述する必要がありますアプリケーションに読み込まれたパラメータがファイルに書かれている方法の詳細）。 各テストは、アクリルの壁を開始する前にそして床は、スーパー次亜塩素水（pHは6〜7）に浸したタオルで拭いていると、グリッドは嗅覚に基づくバイアスを防ぐために、70％エタノールで洗浄される。グリッドは、グリッドによる錆への導電性を軽減しないことを保証するために、エタノールの代わりに超次亜塩素水で拭いている。 2。動物の準備一般的に、二から四のマウスを12時間の明/暗サイクル（ 例えば午前7時に点灯）で温度制御された保持室（23±2℃）でケージあたりに収容されている。 このプロトコルでは、行動にケージ輸送の可能な影響を低減するために、実験環境にマウスを適合させるために、マウスを含むケージは防音試験室で少なくとも30分間に隣接防音待合室に動物保留室から転送され前に、各テストが開始されます。 実験（ 図2A）の全ては、sの間に実行されるべきである異なる時間23,24でテストすることによって生産さ行動の変化を最小限に抑えるために光や暗期中のAMEの期間、毎日。このプロトコルでは、全ての実験は、光期の開始と暗期（明期6:00〜午後8:00 AM）の発症前1時間後に1時間の間で行われている。唯一つの装置が使用可能な場合は、各遺伝子型のマウスは、実験時間および行動パフォーマンスに被験者のテスト順の潜在的影響を低減する相殺ためにテストする必要があります。 ImageFZは4機器の最大を制御することができます。相殺順に4の装置を使用して、同時に4匹をテストする研究者が時間を節約することを可能にすると、マウスの挙動に関する実験パラメータの影響の可能性を低減します。 3。コンディショニングマウスを条件付けチャンバー内に配置され、マウスは、典型的には自由に120秒間チャンバを探索させている。その後、AUこのようなホワイトノイズ、音、聴覚クリッカーとしてditoryキューは、30秒間のCSとして提示され、0.1〜0.8ミリアンペアのフットショックは、音の最後の2秒の間に、米国のようにマウスに与えられている。 CS-USのペアリングのプレゼンテーションは、関連付けを強化するために繰り返される。マウスは、チャンバのコンテキストと嫌悪の経験との間の関連性を確立するために、最後のプレゼンテーション後の時間の長さの室内に放置されています。このプロトコルでは、無料の探査の120秒後に、聴覚信号（ホワイトノイズ、55デシベル）を30秒間提示され、0.3ミリアンペアのフットショックは、ホワイトノイズの最後の2秒の間に連続的に配信されます。 90秒後、フットショックと聴覚信号のペアリングを再度被験者に与えられます。 CS-USのプレゼンテーションでは、セッションごとに3回（120、240、およびコンディショニング開始後360秒）（ 図2B）を繰り返す。最終的なフットショックに続いて、マウスを90秒間チャンバ内に放置されています。 コンディショニングセッションが始まる前に、プラグインのメニュー「FZエアコンとFZオンライン（4室）」を選択し、ImageFZアプリケーションソフトウェアプログラムを実行して、ステップバイステップで、次のようにパラメータ値を設定。 ステップ1：プロジェクトID。あなたのデータファイルを格納するフォルダを指定します。 ステップ2：セッション名。 「セッション」のボックスに、 例えば実験の日付、任意の言葉を入力し、開始時刻とホワイトノイズやフットショックの持続時間は「リファレンス」のボックスに、記述された参照テキストファイルを選択します。サンプルテキストフ​​ァイルは、ビデオに示されている。 ステップ3：パラメータ設定。以下のように各ボックスにパラメータ値を入力します。 レート（フレーム/秒）：画像取得、 例えば、1フレーム/秒のフレームレート。 持続時間（秒）：空調の場合には、全持続時間は480秒である。 ビン時間（秒）： 例えば 、60秒、データは各ブロックで分析される60秒。 対象サイズ – 分（ピクセル）：ImageFZは、各画像内の白い背景に黒の粒子（画素の一部質量）としてマウスやノイズを検出します。ブラック粒子（画素）の領域が「テーマサイズ-分（ピクセル）」未満であるときの値（ 例えば 100画素）、粒子が雑音とみなされ、画像解析から除外される。 MAX（ピクセル） – 対象サイズは：ブラック粒子の大きさが「題目サイズ – 最大（ピクセル） 'のサイズよりも多い場合は、値は、粒子は分析から除外されます。 フレームサイズ-幅/高さ（cm）：チャンバ寸法、 すなわち 33センチメートル広い25センチの高さ。 基準（ピクセル）凍結： 例えば 30ピクセルを、議定書6で詳細を参照してください。 継続時間を凍結-分（秒）： 例えば、2秒、なし、マウスの動きにのみ2以上秒間検出されなかった場合、その動作は「凍結」としてカウントされません;。 ショック·レート（フレーム/秒）：プロトコル6で詳細を参照してください。 ステップ4：件名ID。サブジェクト識別情報を入力してください。 ステップ5：カメラの設定。明るさや撮影した画像のコントラストを制御します。 ステップ6：しきい値設定。各画像における白色の背景に黒色の画素として黒マウスを検出するためのしきい値を調整し、（議定書6で詳細を参照してください）​​ '凍結'または '凍結のないこと」として、マウスの動作を判断する。アルビノマウスを分析するには、チェックボックスの「反転モード」をクリックし、適切にしきい値を調整します。 ステップ7：設定しケイジフィールド。キャプチャする各室のフィールドを指定します。ツールボックスの四角形のボタンをクリックすると、ライブ画像ウィンドウ上室の床の周りに長方形を描きます。次に、チャンバー番号を選択し、「設定」ボタンをクリックしてください。最後に、「完了」ボタンをクリックします。 <パラメータ設定値が設定されている李>後、予備試験は、画像解析システム及び白色雑音/ショック発生が問題なく動作するかどうかを決定するためにその日の最初の試験前の練習マウス（被験体として使用されていないマウス）を用いて与えられるべきである。 隣接する待合室から防音試験室に練習マウスを含むホームケージを移動し、調整チャンバーの各マウスを置く。すぐにチャンバー内にマウスを置いた後、ImageFZの[スタート]ボタンをクリックします。アプリケーションソフトを使用すると、参照ファイルに指定した順序でマウスに聴覚的な手がかり、および/または電気フットショックを紹介します。 480秒が経過した後、ホームケージにマウスを返し、保持室内の棚にケージを戻す。 慎重にチャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックして、試験マウスのための手順を3.2.4-3.6繰り返します。 ImageFZ店は生活し、TIFF形式で画像をトレースします。プログラムが可能に私たちは、修正したパラメータ値を用いて画像を再分析するように、オフライン分析を行う。オフライン分析を行う場合は、メニューのプラグイン「恐怖条件付けとFZオフライン」を選択し、再分析したいデータのフォルダを選択します。その後、再度、入力パラメータ値を、そして「完了」ボタンをクリックします。 4。コンテキストテストコンディショニングセッションが完了した後、マウスを同じコンディショニングチャンバに戻し、文脈的恐怖条件付け（コンテキスト試験）を測定する動作を凍結のため採点する。コンディショニングとコンテキストのテスト間の遅延間隔は、一般的に24時間で設定されています。このプロトコルでは、最近の記憶及び遠隔記憶を評価する（試験1日目で測定し、28日よりコンディショニング後、それぞれ）25、マウスを約24時間および30日間コンディショニングした後にセッションコンテキスト試験に供される。マウスはCONDに配置されますチャンバーをitioning自由CSおよび米国のプレゼンテーション（ 図2C）なしで300秒間室を探索させている。 ImageFZソフトウェアプログラムを実行し、（セクション3.2.3を参照）コンディショニングと同様にして、アプリケーションソフトウェアのパラメータ値を設定するが、300秒までこの試験の継続時間を変更し、コンテキスト·テストのための基準テキストフ​​ァイルを選択。設定を変更した後、予備テストはImageFZシステムをチェックするための練習マウスを用いて与えられるべきである。 空調室に各マウスを置き、[スタート]ボタンをクリックします。 300秒が経過した後、ホームケージにマウスを返し、頭出しのテストが始まるまで邪魔されずにケージにしておきます。 チャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックして、繰り返して、試験マウスで4.3から4.4を繰り返します。 5。手掛かり試験頭出しのテストは、コンテキストのテストの同じ日に、または次の日に行われる。この試験では、マウスを3分間条件付けチャンバーとは無関係である新しいコンテキストを提供する、非常に異なる特性を有する別のテストチャンバ内に配置される。最初の3分間の終わりに、コンディショニング時に提示される聴覚信号は、新規のコンテキスト環境での3分間のマウスに与えられる。このプロトコルでは、手がかり試験は、数時間、コンテキスト試験後に行われる。マウスを360秒間三角室を探索させている。最初の3分間で、CSや米国でもないが提示され、その後、CS（55デシベルホワイトノイズ）は、最後の3分間提示される。 ImageFZソフトウェアプログラムを実行し、360秒の試験の継続時間を変更し、手がかり試験のための基準テキストフ​​ァイルを選択する以外は、コンディショニングと同様にしてパラメータ値を設定する。設定を調整した後、予備テストはImageFZシステムをチェックするための練習マウスを用いて与えられるべきである。 三角室に各マウスを置き、[開始]をクリックしますボタンを押します。 360秒が経過した後、ホームケージにマウスを返すと保持室の棚にケージを戻す。 チャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックしてを繰り返して、試験マウスで5.3から5.4を繰り返します。 さらに、リモートメモリをテストする4-5約30日間のコンディショニングセッション（ 図2A）の後にプロトコルを繰り返します。 6。画像解析自動的ImageFZを使用してデータ収集と分析を行う。このアプリケーション·ソフトウェア·プログラムは、剛宮川によって変更された（国立衛生研究所とhttp://rsb.info.nih.gov/ij/で入手可能でウェインRasbandによって開発された）パブリックドメインImageJのプログラム、（ImageFZアプリケーションソフトウェアに基づいています、無料でダウンロードできます）素材/試薬の表を参照してください。 全ての実験について、を含む、USBビデオキャプチャデバイスを使用してImageFZで所与のフレームレート（ 例えば、1コマ）の画像をキャプチャするビデオカメラ。 、連続した画像から移動した距離を測定し、黒色の粒子（マウス）と白の背景にセグメント画像に設定されているプログラム（ 例えば 80ピクセル）の「しきい値分'の値を調整します。走行距離は、連続する画像のxyにおける粒子の重心座標の各セットの間の距離から計算される。 、連続した画像から凍結挙動を測定するブラック粒子（マウス）に分割した画像を設定し、背景である「しきい値分（XOR） 'プログラムの値（ 例えば 160ピクセル）を、調整し、計算するには連続する画像の各対の粒子間の非オーバーラップ領域の面積の大きさ（ピクセル）。各画像の黒い粒子が尾を除いたマウスの全身の形状と一致するまで、しきい値ツールのスライダーを使って値を調整します。 nonoverlaの面積があればリージョンをpping 'は凍結基準」の値（ 例えば 30ピクセル）未満であり、動作は、一般的に呼吸と心拍を除く任意の動きの完全な欠如として定義されている（ 図3）、'凍結'であると考えられている。領域がこの値を超えると、動作が「非凍結'（ 図3）であると考えられる。判決は、凍結の定義に基づいてなされるべきである。マウスは時々恐怖を反映した凍結挙動と見なされていない可能性があり、微妙な動きや瞬間的な不動を呈する。恐怖の発現とは異なる可能性がある短い時間（ 例えば 2秒未満）、続く不動には、凍結の時間閾値を設定することにより、分析から除外することができる。値（ 例えば 2秒） -時間しきい値、入力'分（秒）凍結期間を'を設定する。 ImageFZプログラムを自動的にカルキユルのATEは、距離が（CM）および凍結の割合を旅した。結果は、テキストフ​​ァイルに保存され、生きおよびトレース画像がTIFF形式で格納されている。距離を測定するために、電気フットショック感受性の指標として（センチメートル）を走行し、ImageFZプログラムは、2まで、2秒のフットショックの送達の前に2秒から測定し、6秒間、高フレームレート（ 例えば 4コマ）の画像を取得するオンライン分析の間フットショック後の秒。その間、および「ショック·レート（フレーム/秒）」ボックスに、フットショック、入力値の後に、前の画像キャプチャのフレームレートを設定します。オンライン分析の後、移動した距離のデータを取得するために「FZショックオフライン 'プラグインのメニューを選択することで、オフライン分析を行う。 ImageFZプログラムのパラメータ値は、予備試験で人間の観察によって得られた結果と同様の結果を生成するために最適化されるべきである。手動スコアリングのために、凍結挙動を連続stopwatcを用いて測定されるhおよびイベント録画プログラムまたはImageFZソフトウェアを用いて分析中に瞬間的な時間サンプリング手順毎に3-10秒。二人の観察者は、一般的に行動観察を行っています。画像解析の結果は、人間の観察者のものと一致していることを保証するためにImageFZプログラムのパラメータ値を調整ImageFZプログラムのオフライン解析を行い、「しきい値分（XOR） 'を変更し、「凍結基準」の値に。オフライン分析を実行するには、プラグインのメニュー「FZオフライン」と入力パラメータ値を選択します。 7。トラブルシューティングどのようにImageFZプログラムを入手し、インストールすることができますか？ ImageFZプログラム（材料/試薬の表を参照してください）​​当社のウェブサイトから無料でダウンロード可能であり、Windowsコンピュータ上で実行されます。 ImageFZ用zipフォルダをダウンロードし、お使いのコンピュータにソフトウェアをインストールしてください。据付けのための「README.TXT」ファイルを参照してください。詳細に関するステップバイステップの指示に従ってください。 なぜエラーメッセージが表示された 'エラーはキャプチャデバイスを設定する」のか？ カメラケーブルの接続やUSBイメージキャプチャデバイスのドライバのインストールを確認してください。設定に問題がない場合は、ImageFZソフトウェアは、画像キャプチャデバイスでは動作しない場合があります。 ImageFZソフトウェアと共に使用するための適切なデバイスに関する「README.TXT」ファイルを参照してください。 ImageFZは粒子としてのマウスの体全体を検出することはできません。 「しきい値分」および/または「しきい値分（XOR）の現在値よりも低い値を設定します。 ImageFZは、試験室の隅例えば 、特定の場所にこのような均一に照明、床やマウスと背景とのコントラストを少しの差として、その後は不十分で試験条件を、マウスを検出できない場合は、存在する可能性があります。この問題を解決するために、パラメータ値を（ 例えば、調整する</eImageFZのM>明るさとライブ画像としきい値のコントラスト）、ライトの数と位置を制御したり、黒のマウス用の白い背景を使用してください。 高フレームレートでキャプチャした画像は、オンライン分析の中にコンピュータが遅くなります。 現在のレートよりも低い値にフレームレートを設定し、オンライン分析を行う。代表的な結果の項に示されているようImageFZ分析は、1 fpsで画像取得により、正確に凍結を測定するために十分である。 ImageFZ分析の結果は、ヒトのスコアのものと一致していない。 保存された画像および判定結果のファイルを調べる。 ImageFZ凍結過大評価した場合、現在の値よりも低い値に '凍結基準」を設定して、オフラインで解析を実行する。 ImageFZ凍結を過小評価した場合、現在の値よりも高い値に「凍結基準」を設定してください。 optogeneticalおよびin vivo電気生理学E 中xperiments、マウスの頭部に装着ファイバケーブルは、凍結の判断を妨害する。 コー​​トは黒のマウス用の白の中のケーブル、およびケーブルが検出されなくなるまでカメラの位置と角度を変更してください。 オフライン解析のために必要とされているの？ ImageFZプログラムのルートディレクトリに「Image_FZ」という名前のフォルダを作成します。このフォルダに、サブフォルダ「画像」と「セッション」を作成。 「イメージ」フォルダに8ビットグレースケール画像を移動し、画像ファイル名が「セッション」フォルダ内に書かれているテキストフ​​ァイルを作成します。その後、ImageFZオフライン分析を実行し、プログラムの指示に従ってください。