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Comportamento

Kontextuelle und Cued Angst Anlage Test mit einer Video-Analyse-System bei Mäusen

Published: March 01, 2014
doi:
10.3791/50871
, , ,
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science,Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency,Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences,National Institutes of Natural Sciences

Summary

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für eine inhaltliche und cued Angst Anlage Test mit einem Videoanalysesystem, Angst zu Lernen und Gedächtnis bei Mäusen zu beurteilen.

Abstract

Die inhaltliche und cued Angst Testanlage ist eine der Verhaltenstests, die die Fähigkeit der Mäuse zu lernen und zu erinnern, einen Zusammenhang zwischen Umweltreize und aversiven Erfahrungen beurteilt. In diesem Test werden Mäuse in einer Klimakammer angeordnet und Schnitzel eines konditionierten Stimulus (ein Gehör cue) und einen aversiven unkonditionierten Stimulus (ein elektrischer Fußschock) gegeben. Nach einer Verzögerungszeit werden die Mäuse auf die gleiche Behandlungskammer und einer anders geformten Kammer mit Darstellung des Gehör Cue ausgesetzt. Einfrieren Verhalten während der Prüfung wird als Index der Angst Speicher gemessen. Um das Verhalten automatisch zu analysieren, haben wir ein Video-Analysesystem mit der Anwendungssoftware ImageFZ, das als kostenloser Download unter http://www.mouse-phenotype.org/ verfügbar ist entwickelt. Hier, um die Details unseres Protokolls zeigen, demonstrieren wir unsere Verfahren für die inhaltliche und cued Angst Anlage Test in C57BL/6J-Mäusen mit der ImageFZ system. Zusätzlich validiert wir unser Protokoll und das Videoanalysesystem durch Vergleichen der Gefrierzeit ImageFZ System oder ein Lichtstrahl-Computer-Messsystem mit dem von einem menschlichen Betrachter hat gemessen. Wie in unserer repräsentative Ergebnisse gezeigt, waren die erhaltenen Daten durch ImageFZ ähnlich denen von einem menschlichen Betrachter untersucht, was anzeigt, dass die Verhaltensanalyse unter Verwendung des ImageFZ System ist sehr zuverlässig. Die vorliegende Film Artikel enthält detaillierte Informationen zu den Testverfahren und das Verständnis der experimentellen Situation zu fördern.

Introduction

Die inhaltliche und cued Angst Anlage Test ist der Verhaltens-Paradigma verwendet, um Angst assoziativen Lernen und Gedächtnis bei Nagetieren 1-3 beurteilen. Dieser Test wurde in großem Umfang verwendet, um die neurobiologischen Mechanismen der Angst Lernen und Gedächtnis in transgenen und Knockout-Mäusen 1,4-16 verstehen. Einfrieren Verhalten, das als völligen Unbeweglichkeit mit Ausnahme der Atem definiert ist, ist eine gemeinsame Reaktion auf Situationen ängstlich. In diesem Verhaltensparadigma, nachdem die Tiere werden zu einer Paarung eines Gehör Cue mit einem elektrischen Fuß-Schock ausgesetzt wird, um die Angst erzeugenden Stimulus reagieren sie durch Anzeigen Gefrierverhalten, das als ein Index der assoziativen Lernen und Gedächtnis Angst gemessen wird. Dieser Test erfordert weniger aufwendige Ausrüstung, weniger körperliche Anstrengung durch den Prüfer, und viel weniger Trainingszeit für Mäuse als andere Lern-und Gedächtnisaufgaben, es erfordert in der Regel ca. 5-10 min / Tag pro Maus für 2 Tage. Obwohl das Testverfahren ist simple und erfordert wenig Zeit, um durchzuführen, muss der Prüfer sorgfältig beobachten und messen Mausverhalten, daher mehrere automatisierte Messsysteme wurden entwickelt, um die Verhaltensanalyse von 17 bis 20 durchzuführen. Unsere Video-Analyse-System, das wir mit dem Software-Programm entwickelt ImageFZ, ermöglicht es uns, einfach analysieren Gefrierverhalten und produzieren sehr zuverlässige Ergebnisse. Dieser Artikel enthält detaillierte Informationen zu unseren Testverfahren und beschreibt, wie die ImageFZ Software-Programm verwenden.

Protocol

Alle Versuche sollten nach den Leitlinien und Protokolle von lokalen Animal Care und Verwenden Ausschüsse etabliert durchgeführt werden. 1. Geräte-Einstellung Die Vorrichtung für die Konditionierung und Kontext-Test ist ein Quadrat Kammer mit einer aufladbaren Gitterboden, eine Schallquelle und ein kalibriertes Schockgenerator. Verschiedene Kammergrößen verwendet werden, mit unterschiedlichen Abmessungen von 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 bis 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. In diesem Protokoll, wobei die Vorrichtung besteht aus einer Acryl quadratische Kammer (33 cm x 25 cm x 28 cm, transparent in den vorderen und hinteren Wänden, weiß in den Seitenwänden) mit Metallgitter (0,2 cm Durchmesser, 0,5 cm voneinander beabstandet sind) abgedeckt durch eine transparente Acryl Deckel (Fig. 1A). Es ist notwendig, um die Kammer auf einem weißen Acryl Boden (1B) zu platzieren, um das Verhalten von Schwarz, Agouti, oder verdünnter braunen Mäusen zu analysieren, weil ein Bildanalysesystem mit dem ImageFZ Software-Programm (zum kostenlosen Download zur Verfügung, siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) zeichnet ein dunkles Motiv aus einem weißen Hintergrund in jedes aufgenommene Videobild. Albino-Mäuse können auch mit schwarzen Metallgitter und eine schwarze Acryl-Boden (Abbildung 1B) getestet werden. Licht-emittierende Diode (LED) an der Decke über der Vorrichtung angebracht. Der Gitterboden bei 100 Lux von den LED-Lichtern beleuchtet. Ein Lautsprecher mit einem weißen Rauschen / Tongenerator (1C) verbunden ist, an einer Decke 5 cm oberhalb des Deckels, um eine auditive Cue (ein weißes Rauschen 55 dB) als bedingter Reiz (CS) vorhanden montiert. Die Gitter sind mit einem Schockgenerator (Abbildung 1C) verdrahtet, um einen elektrischen Fuß-Schock wie der unbedingte Reiz (US) zu liefern. Die Testkammer ist in einem schalldichten Raum (170 cm x 210 cm x 200 cm) (1D), um Außengeräusche während der Tests zu minimieren platziert. Dieser Zustand verhindert auch, dass die Mäuse, die derzeit nicht auf ein unterzogen werden,testen aus dem Hören eine auditive Stimmung oder die Vokalisation der Test Mäusen. Die Vorrichtung zur cued Test einer Kammer, die andere Eigenschaften als der Konditionierungskammer besteht, Bereitstellen eines neuen Kontext. Es ist zwingend notwendig, um die Sinneseindrücke so viel wie möglich zu ändern, so dass die Maus nimmt den Roman Zusammenhang als nicht mit der Klimakammer. Im allgemeinen ein anders geformter Kasten oder eine dreieckige Kammer verwendet. Darüber hinaus werden verschiedene Beleuchtungs-und / oder Geruchssinn auch an der Maus vorgesehen. In diesem Protokoll ist die Vorrichtung eine Acryldreieckige Kammer (33 cm x 29 cm x 32 cm, weiß in jeder Seitenwand) mit einem flachen, weißen Boden für Schwarz, Agouti, oder verdünnte braune Mäuse oder einer flachen, schwarzen Boden für Albino Mäuse, mit einem transparenten Acryl Deckel (1E) abgedeckt ist. LED-Leuchten sind an der Decke über der Vorrichtung angebracht. Die Ausleuchtung des Bodens bei 30 Lux eingestellt. Ein Lautsprecher ist an der Decke 5 cm oberhalb des Deckels montiert zu prEsent eine auditive Cue, die die gleiche wie die an die Mäuse zum Zeitpunkt der Anlage vorgesehen ist. Die dreieckige Kammer in einer anderen schalldichten Raum aus dem Raum, in dem der Testanlage und Rahmen angeordnet sind, durchgeführt. Jede Kammer ist mit einem Decken Charge Coupled Device (CCD) Kamera an einen Windows-Computer über Quad-Video-Splitter und USB-Bildaufnahmeeinrichtung an das Verhalten der Maus zu überwachen, und die Bilder von der Vorrichtung und der Maus ausgestattet sind, durch die erfasst und analysiert Anwendungssoftware ImageFZ (siehe Protokoll Nr. 6). Die weißen Rauschen und Fußschock Generatoren werden automatisch von der Software ImageFZ Programm gesteuert, die Startzeit und Dauer des weißen Rauschens und Fußschock muss in eine Textdatei geschrieben werden (siehe eine Beispiel-Textdatei "einfach-cond 'in dem Video für die gezeigte Details, wie die Parameter in die Datei geschrieben werden), die in der Anwendung gelesen wird. Vor jedem Test beginnt, die Acrylwändeund Böden sind mit einem Handtuch in der Super Hypochlor Wasser (pH 6-7) getränkt abgewischt und die Gitter mit 70% Ethanol gereinigt, um eine Vorspannung auf Basis von Geruchssinn zu verhindern. Die Gitter sind mit Ethanol anstelle von Super hypochlorige Wasser gespült, um sicherzustellen, daß die Gitter nicht ihre elektrische Leitfähigkeit aufgrund von Rost zu verringern. 2. Vorbereitung der Tiere Generell werden zwei bis vier Mäuse pro Käfig in einem temperaturgesteuerten Halteraum (23 ± 2 ° C) mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus (zB Licht an um 7.00 Uhr) untergebracht. In diesem Protokoll, um mögliche Einflüsse auf das Verhalten Käfig Transport zu reduzieren und die Mäuse zum experimentellen Umgebung anzupassen, werden die Käfige, die die Mäuse von der Tierhalteraum in einem schalldichten Warteraum neben einer schalldichten Testraum mindestens 30 min über vor jedem Test beginnt. Alle Versuche (2A) ist in den s durchgeführt werden,ame Zeitraum, in dem Licht-oder Dunkelphase jeden Tag, um die Verhaltensänderungen, die durch die Prüfung zu verschiedenen Zeiten 23,24 produziert minimieren. In diesem Protokoll werden alle Versuche zwischen 1 Stunde nach dem Beginn der Lichtphase und 1 h vor Beginn der Dunkelphase (8.00 bis 18.00 Uhr in der leichten Phase) durchgeführt. Wenn nur ein Gerät zur Verfügung steht, sollte Mäusen jedes Genotyps in einer ausgeglichen, um mögliche Auswirkungen der Versuchszeit und die Prüfung der Reihenfolge der Themen auf die Verhaltensleistung verringern getestet werden. ImageFZ können maximal 4 Geräte steuern. Prüfung 4 Mäuse gleichzeitig unter Verwendung von 4 Geräten in einem ausgeglichen Bestellung ermöglicht der Forscher um Zeit zu sparen und reduziert die möglichen Auswirkungen der experimentellen Parameter auf Mausverhalten. 3. Anlage Mäuse werden in der Aufbereitungskammer angeordnet ist, und die Mäuse werden typischerweise erlaubt, frei in die Kammer für 120 Sekunden zu erkunden. Danach wird die Au-ditory Cue, wie ein weißes Rauschen, Ton und Gehör Clicker wird als CS für 30 Sekunden präsentiert, und eine 0,1 bis 0,8 mA Fußschock während der letzten 2 Sekunden der Ton den Mäusen als US-gegeben. Die Präsentation des CS-US-Paarung wird wiederholt, um den Verein zu stärken. Die Mäuse werden in der Kammer für eine Zeitdauer nach der letzten Darstellung links nach weiteren stellen die Verbindung zwischen dem Rahmen der Kammer und der aversive Erfahrung. In diesem Protokoll nach 120 sec freier Exploration, eine auditive Cue (weißes Rauschen 55 dB) wird für 30 sec dargestellt, und ein 0,3 mA Fußschock kontinuierlich während der letzten 2 Sekunden des weißen Rauschens geliefert. Nach 90 Sekunden wird die Paarung des Gehör Cue mit der Fuß-Schock auf die Themen wieder gegeben. Die Darstellung der CS-US wiederholt dreimal pro Sitzung (120, 240 und 360 Sekunden nach dem Beginn der Konditionierung) (2B). Nach dem abschließenden Fußschock werden die Mäuse ungestört in den Kammern 90 s belassen. Bevor die Anlage Sitzung beginnt, führen Sie den ImageFZ Anwendungssoftware Programm, wählen Sie das Plug-in Menü 'FZ Anlage und FZ Online (4-Kammer) ", und legen Sie die Parameterwerte Schritt-für-Schritt wie folgt. Schritt 1: Projekt-ID. Geben Sie einen Ordner, in dem Sie Ihre Dateien speichern möchten. Schritt 2: Session Name. Geben Sie alle Wörter, z. B. die experimentelle Datum, im Feld "Session", und wählen Sie einen Verweis Textdatei, in der die Startzeit und Dauer des weißen Rauschens und Fußschock geschrieben werden, in der "Reference"-Box. Eine Probe Textdatei wird in dem Video gezeigt. Schritt 3: Parameter-Einstellungen. Geben Sie Parameterwerte in jeder Box wie folgt. Rate (Bilder / s): Frame-Rate der Bildaufnahme, z. B. 1 Bild / Sek. Dauer (sec): im Fall von Anlage, ist die Gesamtlaufzeit 480 sek. Bin Dauer (sec): z. B. 60 sec, die Daten in jedem Block analysiert60 sek. Betreff Größe – min (Pixel) ImageFZ erkennt eine Maus und Lärm als schwarze Partikel (einige Masse der Pixel) in einem weißen Hintergrund in jedem Bild. Wenn die Fläche der schwarzen Teilchen (Pixel) kleiner als der "Gegenstand Größe – min (Pixel)" ist der Wert (z. B. 100 Pixel), die Teilchen als Rauschen betrachtet und werden von der Bildanalyse ausgeschlossen. Betreff Größe – max (Pixel), wenn die Größen der schwarzen Partikel sind mehr als die Größe des "Vorbehaltlich Größe – max (Pixel)" Wert, werden die Partikel von der Analyse ausgeschlossen. Rahmengröße – Breite / Höhe (cm): Kammer Dimension, dh 33 cm breit und 25 cm hoch. Einfrieren Kriterium (Pixel): z. B. 30 Pixel, finden Sie die Details in Protokoll Nr. 6. Einfrieren Dauer – min (sec): zB 2 Sek.; wenn keine Bewegung der Maus ist nur für weniger als 2 Sekunden erkannt wird, wird sein Verhalten nicht als "Einfrieren" gezählt;. Stoßrate (Bilder / s): siehe die Details in Protokoll Nr. 6. Schritt 4: Betreff ID. Geben Sie das Thema Identifikation. Schritt 5: Kamera-Einstellungen. Steuern Sie die Helligkeit und den Kontrast des erfassten Bildes. Schritt 6: Threshold-Einstellungen. Stellen Sie die Grenzwerte, um eine schwarze Maus als schwarze Pixel in einem weißen Hintergrund in jedem Bild zu erkennen und Mausverhalten als "Einfrieren" oder "Nicht-Einfrieren" zu beurteilen (siehe die Einzelheiten in Protokoll Nr. 6). Um einen Albino-Maus zu analysieren, klicken Sie auf das Kontrollkästchen "Invert-Modus", und geben Sie die entsprechenden Schwellenwerten. Schritt 7: Set Cage Field. Geben Sie den Bereich der jeweiligen Kammer, die Sie aufnehmen möchten. Nachdem Sie auf die Schaltfläche Rechteck in der Toolbox, ein Rechteck um den Boden der Kammer auf dem Live-Bild-Fenster. Als nächstes wählen Sie die Anzahl Kammer und klicken Sie auf "Set"-Taste. Klicken Sie abschließend auf die "Complete"-Taste. <li> Nachdem die Parameter eingestellt sind, sollte ein Vorbereitungstest mit Praxis-Mäusen (Mäusen, nicht als Subjekte verwendet) vor dem ersten Test des Tages, um zu bestimmen, ob das Bildanalysesystem und weißes Rauschen / Schock Generatoren arbeiten ohne Probleme gegeben werden. Bewegen Sie ein Haus Käfig mit Mäusen, die Praxis der schallisolierten Testraum von der angrenzenden Warteraum, und platzieren Sie jede Maus in der Klimakammer. Unmittelbar, nachdem man den Mäusen in der Kammer, klicken Sie auf den Startknopf des ImageFZ. Die Anwendungssoftware wird akustische Signale und / oder elektrische Fußschocks den Mäusen in der Reihenfolge, dass Sie in einer Referenzdatei angeben zu präsentieren. Nach 480 Sekunden abgelaufen ist, kehren die Mäuse in ihre Heimat zurückkehren Käfig und den Käfig zu dem Regal in der Halteraum. Reinigen Sie die Kammern sorgfältig. Klicken Sie dann auf "Next-Analyse"-Taste und wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.6 für die Test-Mäusen. ImageFZ speichert leben und Spuren Bilder im TIFF-Format. Das Programm erlaubtuns eine Offline-Analyse durchzuführen, um die Bilder erneut analysieren mit geänderten Parameterwerte. Wenn Sie eine Offline-Analyse durchzuführen, wählen Sie die Plug-in-Menü 'Angstkonditionierung und Offline-FZ "und wählen Sie den Datenordner, die Sie erneut analysieren möchten. Danach geben Sie die Parameterwerte wieder, und klicken Sie auf die "Complete"-Taste. 4. Context-Test Nachdem die Anlage Sitzung beendet ist, werden die Mäuse auf den gleichen Konditionierungskammer zurück und hat zum Einfrieren Verhalten kontextuell bedingt Angst (Kontext-Test) zu messen. Eine Verzögerungsintervall zwischen dem Anlage und Kontext Test wurde allgemein mit 24 h eingestellt. In diesem Protokoll zu den letzten Speicher-und Remote-Speicher 25 (von der Test 1 Tag und mehr als 28 Tage nach Anlage, gemessen) zu beurteilen, werden die Mäuse auf den Kontext Test rund 24 Stunden und 30 Tage nach der Sitzung Anlage unterzogen. Die Mäuse werden in der cond platziertitioning Kammer und sind erlaubt, um die Kammer für 300 Sekunden frei erkunden, ohne CS und US-Präsentationen (Abbildung 2C). Führen Sie das ImageFZ Software und Parameterwerte der Anwendungssoftware in der gleichen Weise wie in der Anlage (siehe Abschnitt 3.2.3), aber ändern Sie die Dauer des Tests auf 300 sec und wählen Sie einen Verweis Textdatei für den Kontext Test . Nach der Änderung der Einstellung sollte ein Vorbereitungstest mit der Praxis, um die Mäuse ImageFZ System zu überprüfen gegeben werden. Platzieren Sie jede Maus in der Klimakammer und klicken Sie auf den Startknopf. Nach 300 Sekunden abgelaufen ist, kehren die Mäuse in ihre eigenen Käfig, und lassen Sie den Käfig ungestört, bis der cued Test beginnt. Reinigen Sie die Kammern. Klicken Sie dann auf "Next-Analyse"-Taste und wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,4 in den Testmäusen. 5. Cued-Test Cued Test am gleichen Tag von Rahmen-Test oder am nächsten Tag durchgeführt.In diesem Test werden Mäuse in einen anderen Testkammer mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften angeordnet und bietet einen neuen Rahmen, die nicht mit der Behandlungskammer 3 min ist. Am Ende der ersten 3 Minuten wird der Gehör Cue, die zum Zeitpunkt der Anlage dargestellt wird, um Mäuse für 3 min in dem erfindungsgemäßen Zusammenhang Umgebung abgegeben. In diesem Protokoll ist markiert Test ein paar Stunden nach dem Kontext Test durchgeführt. Mäuse dürfen die dreieckige Kammer 360 sec zu erforschen. In der ersten 3 min, weder eine US-CS noch präsentiert wird, und danach wird ein CS (a dB weißem Rauschen 55) für die letzten 3 min vorgestellt. Führen Sie das ImageFZ Software-Programm und legen Sie die Parameterwerte in der gleichen Weise wie in Anlage, außer ändern Sie die Dauer des Tests auf 360 sec und wählen Sie einen Verweis Textdatei für die cued Test. Nach dem Einstellen der Einstellung sollte ein Vorbereitungstest mit der Praxis, um die Mäuse ImageFZ System zu überprüfen gegeben werden. Platzieren Sie jede Maus in das dreieckige Kammer und klicken Sie auf den Start–Taste. Nach 360 Sekunden abgelaufen ist, kehren die Mäuse in ihre Heimat zurückkehren Käfig und den Käfig zu dem Regal der Halteraum. Reinigen Sie die Kammern. Dann klicken Sie auf die "Next-Analyse"-Taste und wiederholen Sie die Schritte von 5,3 bis 5,4 in den Testmäusen. Um weiter zu testen entfernten Speicher, wiederholen Sie die Protokolle 5.4 etwa 30 Tage nach der Sitzung Anlage (2A). 6. Bildanalyse Führen Sie die Datenerfassung und Analyse automatisch mit ImageFZ. Diese Anwendung Software-Programm wird auf der Public Domain Programm ImageJ (Wayne Rasband an den National Institutes of Health und an http://rsb.info.nih.gov/ij/ entwickelt), durch Tsuyoshi Miyakawa geändert (ImageFZ Anwendungssoftware , zum kostenlosen Download zur Verfügung, siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Für alle Versuche, die Aufnahmen zu einem bestimmten Bildrate (z. B. 1 fps) mit ImageFZ mit einem USB-Videoaufnahmegerät, darunter einVideokamera. So messen Sie den Abstand von den aufeinanderfolgenden Bildern gereist, Wert des Programms (z. B. 80 Pixel), die auf die Segment die Bilder in einem schwarzen Teilchen (eine Maus) und einem weißen Hintergrund ist die "Schwelle min. Der zurückgelegte Weg wird von dem Abstand zwischen jedem Satz von xy-Koordinaten für den Schwerpunkt der Partikel in den aufeinanderfolgenden Bildern berechnet. Um das Einfrieren Verhalten von den aufeinander folgenden Bildern zu messen, stellen Sie die "Schwelle min (xor)" Wert des Programms (z. B. 160 Pixel), das Segment die Bilder in einem schwarzen Teilchen (Maus) und den Hintergrund gesetzt, und dann berechnen die Menge Bereich (Pixel) des nicht überlappenden Bereiche zwischen den Teilchen von jedem Paar von aufeinanderfolgenden Bildern. Stellen Sie den Wert mit dem Schieberegler der Schwelle Werkzeug, bis die schwarze Partikel in jedem Bild die Form des gesamten Körpers mit der Maus ohne Schwanz passt. Wenn die Fläche des nonoverlapping Region unter dem "Einfrieren Kriterium" Wert (z. B. 30 Pixel) wird das Verhalten als (Figur 3), die im Allgemeinen als das völlige Fehlen von jeglicher Bewegung außer Atmung und Herzschlag definiert ist "Einfrieren". Wenn der Bereich diesen Wert überschreitet, wird das Verhalten als "nicht-Einfrieren" (Fig. 3). Das Urteil sollte basierend auf der Definition des Einfrierens werden. Mäuse weisen manchmal eine subtile Bewegung und eine momentane Immobilität, die nicht als Gefrierverhalten, die Angst spiegelt angesehen werden könnten. Die Unbeweglichkeit, die für eine kurze Zeit (z. B. weniger als 2 Sekunden), die wahrscheinlich verschieden von der Manifestation der Angst dauert, kann aus der Analyse, indem die Zeitschwelle des Einfrierens ausgeschlossen. Wert (zB 2 Sek.) – Um die Zeitschwelle, Eingang 'min (sec) Einfrieren Dauer' gesetzt. Die ImageFZ Programm automatisch calculAtes die zurückgelegte Strecke (cm) und der Anteil der Gefrierpunkt. Die Ergebnisse werden in Textdateien gespeichert haben, und leben und Spuren Bilder in einem TIFF-Format gespeichert. Zur Messung der zurückgelegten Entfernung (cm) als Index der elektrischen Fuß-Schock Empfindlichkeit, erwirbt der ImageFZ Programm auch Bilder mit hoher Bildrate (zB 4 fps) für 6 Sekunden, bevor die Lieferung von 2 Sek. Fußschock von 2 Sekunden gemessen, bis 2 s nach Fußschock während der Online-Analyse. Um die Bildrate für die Bilderfassung vor eingestellt, während und nach der Fuß-Schock, Eingang ein Wert in der 'Shock Rate (Bilder / s) "-Box. Nach der Online-Analyse, die Offline-Analyse durchführen, indem Sie einen Plug-in-Menü 'FZ Shock offline ", um die Daten für die zurückgelegte Strecke zu erhalten. Die Parameterwerte des ImageFZ Programm sollte optimiert werden, um ähnliche Ergebnisse wie die von menschlichen Betrachtern in vorbereitenden Tests erhaltenen erzeugen. Für manuelle Auswertung wird die Gefrierverhalten kontinuierlich mit einem stopwatc gemessenh und ein Ereignis-Aufnahmeprogramm oder eine momentane Zeitstichprobenverfahren alle 3-10 sec, während der Analyse mit ImageFZ Software. Zwei Beobachter der Regel führen die Verhaltensbeobachtung. So passen Sie die Parameterwerte der ImageFZ Programm, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse der Bildanalyse im Einklang mit denen der menschliche Beobachter sind, führen Sie eine Offline-Analyse der ImageFZ Programm, Modifizieren der 'Schwelle min (XOR) "und" Einfrieren Kriterium "Werte . Um die Offline-Analyse durchzuführen, wählen Sie das Plug-in Menü 'FZ offline "und geben alle Parameterwerte. 7. Störungssuche Wie kann die ImageFZ Programm erhalten und installiert werden? Die ImageFZ Programm ist zum kostenlosen Download auf unserer Website zur Verfügung (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) und läuft auf einem Windows-Computer. Laden Sie die Zip-Ordner für ImageFZ und installieren Sie die Software auf Ihrem Computer. Siehe die Datei "readme.txt" für die Installaauf Details und folgen Sie den Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Warum wird die Fehlermeldung "Fehler beim Setzen Aufnahmegerät 'angezeigt? Überprüfen Sie die Verbindung der Kamera-Kabel und Ihr Fahrer Installation des USB-Bildaufnahmeeinrichtung. Wenn es kein Problem mit den Einstellungen, dann die ImageFZ Software nicht mit der Bildaufnahmeeinrichtung zu arbeiten. Siehe die Datei 'readme.txt' über das entsprechende Gerät mit ImageFZ-Software verwenden. ImageFZ kann der gesamte Körper der Maus nicht erkennt als Teilchen. Setzen Sie den Wert "Schwelle min 'und / oder' Schwelle min (xor)" niedriger als der aktuelle Wert. Wenn ImageFZ können die Maus an einem bestimmten Ort, z. B. der Ecke einer Testkammer nicht erkennen kann, dann unzureichend Testbedingungen, wie z. B. einem gleichmäßig ausgeleuchteten Boden oder einem leicht kontras Unterschied zwischen der Maus und dem Hintergrund existieren könnte. Um dieses Problem zu lösen, die Parameterwerte (z. B. </em> Helligkeit und Kontrast der Live-Bild-und Schwellenwerte) der ImageFZ, steuern die Anzahl und Position der Lichter, oder verwenden Sie einen weißen Hintergrund für eine schwarze Maus. Bildaufnahme mit einer hohen Bildrate verlangsamt den Computer während des Online-Analyse. Stellen Sie die Bildrate auf einen niedrigeren Wert als der Tagessatz, und führen Sie die Online-Analyse. Die ImageFZ Analyse, durch die Bildaufnahme von 1 fps, ist ausreichend für die genaue Messung Gefrierpunkt, wie in der repräsentative Ergebnisse Schnitt gezeigt. Die Ergebnisse der Analyse ImageFZ nicht mit denen der menschlichen Wertung zustimmen. Untersuchen Sie das gespeicherte Bild-und Beurteilungsergebnis-Dateien. Wenn ImageFZ Einfrieren überschätzt, stellen Sie das "Einfrieren Kriterium" auf einen niedrigeren Wert als der aktuelle Wert, und führen Sie die Offline-Analyse. Wenn ImageFZ Einfrieren unterschätzt, setzen Sie das "Einfrieren Kriterium" auf einen höheren Wert als der aktuelle Wert. In optogenetical und in vivo elektro eXperimente, die Faser-Kabel an den Kopf der Maus befestigt stört das Urteil des Einfrierens. Bestreichen Sie die Kabel in weiß für eine schwarze Maus, und ändern Sie die Position und den Winkel der Kamera, bis die Kabel werden nicht erkannt. Was ist für die Offline-Analyse benötigt? Erstellen Sie einen Ordner namens 'Image_FZ "im Root-Verzeichnis des ImageFZ Programm. In diesem Ordner der Unterordner Images "und" Sessions ". Verschieben eines 8-Bit-Graustufenbild zu Ordner "Bilder", und erstellen Sie eine Textdatei, in der der Name der Bilddatei in den Ordner "Sessions" geschrieben. Danach führen Sie den ImageFZ Offline-Analyse, und folgen Sie den Anweisungen des Programms.

Representative Results

In der Furcht Anlage Test verwendet menschlichen Experimentatoren, um die Gefrierverhalten durch arbeitsintensive direkte Beobachtung 26-29 quantifizieren, aber vor kurzem photobeam-Computer Messung (z. B. die "Freeze-Monitor"-System) und Bildanalysesysteme zur automatischen worden messen die Gefrierverhalten 26,30-32. ImageFZ ist ein automatisiertes Bildanalysesystem, die Ergebnisse vergleichbar mit denen durch menschliche Beobachtung erhaltenen erzeugt, wie unten beschrieben. Hier verglichen wir die Ergebnisse der menschlichen Beobachtung mit denen ImageFZ Analyse unter variierenden Parameter: 'Rate (Bilder / s) "und" Einfrieren Kriterium (Pixel). " In diesem Experiment fünf männliche C57BL/6J Mäusen (Mittelwert ± SD Körpergewicht (g), 31,4 ± 3,55, Durchschnittskörpergröße ± SD (Pixel), 351,6 ± 62,2) wurden bei 15 bis 27 Wochen alt verwendet. Die menschliche Beobachtung wurde mit einer ereignisAufnahmeProgramm (a Macintosh OS9-Software-Programm) gemacht, ein Schlüssel-Ereignis, das weiter drückend 2 s oder mehr, wenn eine Maus angezeigt einen Anfall von keiner Bewegung wurde als "Einfrieren". Der Anteil der Gefrierpunkt wurde alle 60 Sekunden in jedem Test berechnet und verwendet für Korrelationsanalysen. Der Prozentsatz des Einfrierens der Beobachter 2 hat (Interobserver Zuverlässigkeit, zum Konditionieren, r = 0,879; kontext Test r = 0,957; für cued Test, r = 0,866, für alle Fälle, r = 0,888) wurden gemittelt, um einen Menschen zu erzeugen, punkten. Korrelationen zwischen den Gefrierpunkt Prozent durch ImageFZ mit jedem Bildrate (dh 1, 2, und 4 fps) gemessen und die durch menschliche Beobachtungen erhalten wurden untersucht. Wie in Fig. 4 dargestellt ist, wurden die Prozentsätze durch Einfrieren ImageFZ (1, 2, und 4 fps) berechnet stark mit dem Mittelwert aus den Messungen der Beobachter 2 erhalten korreliert. Bemerkenswert ist, die Aufnahme von Bildern mit einer höheren Framerate nicht immer die beste Korrelation zu produzieren. Bildanalyse bei 1 fps erzeugt ähnliche Ergebnisse wie die von menschlichen Beobachtern in E erhaltenach Test. Korrelationen zwischen den Gefrierpunkt Prozent durch menschliche Beobachtungen gemessen und mit ImageFZ unter jeder Bedingung der "Einfrieren Kriterium (Pixel)" (dh 20, 30 und 40 Pixel) untersucht. Die Gefrierprozente berechnet ImageFZ zu den "Null Kriterium (Pixel)" 20, 30 und 40 Pixel wurden in allen Fällen hoch mit denen durch menschliche Beobachtung erhalten (Fig. 5) korreliert. Wie in 5D, wenn das Einfrieren Kriterium auf einen niedrigen Wert, der subtilen Bewegung der Maus, werden als "Einfrieren" von menschlichen Betrachtern eingestellt angezeigt wird, würde als "Nicht-Einfrieren" mit ImageFZ werden. Umgekehrt, wenn das Kriterium auf einen hohen Wert gesetzt ist, die Bewegung der Maus, hat als "nicht Einfrieren 'von menschlichen Beobachtern, würde als" Einfrieren "mit ImageFZ (5C, 5F und 5I). So, um verlässliche Ergebnisse zu erhalten, die einzelnen Parameter der ImageFZ Programm sollte uns kalibriert werdenten die durch menschliche Beobachtungen in jeder Testumgebung hat Daten. Außerdem verglichen wir die Ergebnisse durch einen menschlichen Beobachter erzeugt, mit einem photobeam-Computer-Messsystem (Freeze-Monitor-System), mit denen unter Verwendung ImageFZ erhalten (siehe Abbildung 6). Der menschliche Beobachter zu der Behandlungsgruppe und die Ergebnisse der Bewertungs ImageFZ geblendet. Für die Parametereinstellungen der Freeze-Monitor-System, haben wir drei Maßnahmen des Prozentsatzes des Einfrierens von einem zuvor validierten System 30. Kurz gesagt, die Anzahl von 10-Sekunden-Intervallen, in denen die Tiere benötigt mehr als 1 oder 2 Sekunden, um die erste neue Strahl des Intervalls (1s und 2s 10s 10s bezeichnet) und der Latenzzeit zwischen dem Beginn eines jeden Intervalls 5 Sekunden überschreiten und die dritte neue Strahlunterbrechung innerhalb dieses Intervalls (Latency3) gemessen. Die Prozentsätze der Intervalle, während der die Maus Einfrieren oder der Prozentsatz der Gesamtzeit required brechen die dritte photobeam berechnet. Die Prozentsätze des Einfrierens in jedem System gemessen sind in Fig. 6 dargestellt. Die Gruppen wurden unter Verwendung von Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von t-Tests (siehe Tabelle 1) verglichen. Die Gefrierprozente gemessen mit ImageFZ (6B) waren ähnlich denen durch menschliche Beobachtung (6A) hat als die Verwendung eines Lichtstrahlbasiertes System (Fig. 6C-D) erhaltenen Daten. Die Prozentsätze Gefrierpunkt gemessen mit der ImageFZ Programm in jedem Test waren hoch mit den durch die menschliche Beobachtung hat korreliert (Anlage, r = 0,947; Kontext Test, r = 0,970; cued Test, r = 0.934), während die Korrelationen zwischen den Gefrierpunkt gemessen Prozent mit der photobeam-Computer-Messsystem (1sec 10sec, 10sec 2s oder Latency3) und die menschlichen Beobachter waren niedriger (Anlage, r = 0,503, 0,593, 0,761 und; Zusammenhang test, r = 0,772, 0,819, 0,912 und) im Vergleich zu den Korrelationen zwischen den Gefrierpunkt Prozentsätze gemessen mit ImageFZ und Menschenbeobachtung (7A und 7B). Zusätzlich Fig. 7 zeigt, dass die Unterschiede zwischen den Gefrierpunkt Prozent durch menschliche Beobachtung gewonnen und mit ImageFZ in jeder Maus wurden die geringsten Unterschiede. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Gefrierprozente gemessen mit ImageFZ bei der Messung der Menge an Gefrier waren ähnlich wie jene, die durch menschliche Beobachtung und dass ImageFZ erhalten ist sehr genau. Fig. 1 ist. Die Apparate für die inhaltliche und cued Angst Anlage Test. (A) Eine Acryl quadratischen Raum für die Konditionierung und Kontext-Test, ( <strong> B) Metallgitter auf einem weißen Kunststoff-Boden für Schwarz, Agouti, oder verdünnte braune Mäuse (oben) und elektrifizierbaren schwarzen Metallgitter auf einem schwarzen Kunststoffboden für weiße Mäuse (unten); vergrößerte Bilder der Gitter in die richtige gezeigt Platte, (C) ein weißes Rauschen / Tongenerator und eine Schockgenerator, (D) ein schalldichter Raum, und (E) eine Acryldreieckige Kammer mit einem flachen Boden für die cued Test. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 2. Schematische Darstellung des Protokolls. (A) Überblick über die inhaltliche und cued Angst Testanlage, (B) Anlage, (C) context Test, und (D) cued Test. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 3. Bildanalyse durch die ImageFZ Softwareprogramm. Für jedes Paar von aufeinanderfolgenden Bildern, wird die Menge des Bereich (Pixel), durch die sich die Maus bewegt wird, indem ImageFZ berechnet. Wenn dieser Bereich unter einem bestimmten Schwellenwert (z. B. 30 Pixel) wird das Verhalten beurteilt werden "Einfrieren". Wenn die Menge der Fläche entspricht oder den Schwellenwert überschreitet, wird das Verhalten als "nicht-Einfrieren" werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 4. Vergleiche der Gefrierpunkt Prozentsätze von den Bildern an unterschiedlichen Bildraten mit ImageFZ mit denen durch menschliche Beobachtung gemessen berechnet. Die Furchtkonditionierung Tests wurden mit männlichen C57BL/6J Mäusen (n = 5) durchgeführt. Während der Tests erzielte das Einfrieren Verhalten zwei Beobachter. Gleichzeitig wurden Live-Bilder bei 4 fps mit der ImageFZ Programm eingefangen. Die bei 4 fps aufgenommene Dateien wurden nach dem Extrahieren der Frames, um Bilder von 1 fps oder 2 Bilder pro Sekunde erfasst entsprechen verkleinert. Die Parameterwerte der 'Rate (Bilder / s) "wurden auf 1, 2 oder 4 fps, und das Einfrieren Prozentangaben jeweils 60-sec bin wurden von Bilddateien mit ImageFZ Offline-Analyse berechnet. Jeder Punkt steht für einen Gefrierpunkt Prozentsatz von jedem 60-sec bin. Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen den von der menschlichen Beobachtung und ImageFZ Analyse erhaltenen Daten wurden berechnet.Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 5. Die Gefrierprozente aus den Bildern bei unterschiedlichen Gefrierkriteriumswerte mit ImageFZ und die durch menschliche Beobachtungen gemessen wurde, berechnet wurden, verglichen. Die Angstkonditionierung Prüfungen wurden männliche C57BL/6J Mäuse (n = 5) durchgeführt. Während der Tests aufgezeichnet zwei Beobachter die Gefrierverhalten und die Live-Bilder wurden mit dem Programm ImageFZ gefangen genommen. Die Gefrierprozentangaben jeweils 60 Sekunden bin aus den Bilder (1 Bild / s) durch ImageFZ Offline-Analyse berechnet werden, die Einstellung der Parameterwerte "Einfrieren Kriterium (Pixel)" auf 20, 30 oder 40 Pixel. Jeder Punkt steht für einen Gefrierpunkt Prozentsatz von jedem 60-sec bin. Pearson-KorrelationskoeffizientenKoeffizienten zwischen den aus menschlichen Beobachtung und Analyse der ImageFZ erhaltenen Daten wurden in jedem Test berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 6. Die Prozentsätze des Gefrierens wurden unter Verwendung automatisierter Systeme und menschliche Beobachtung unkonditionierten und konditionierten in Gruppen von männlichen C57BL/6J Mäuse (n = 5 pro Gruppe) gemessen. (A) Menschenbeobachtung, (B) ImageFZ, (C) Gefrier Monitor-System 1 (1sec 10sec), (D) Gefrier Monitor-System 2 (2 Sek. 10 Sek.) und (E) Gefrier-Monitor-System 3 (Latency3). Gruppenvergleiche wurden mit Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von t-Tests (unkooperativnditioned-Gruppe vs Gruppe Anlage, *, P <0,05; †, p <0,01). Die Verwendung ImageFZ waren ähnlich wie die durch menschliche Beobachtung gewonnenen Daten erzielt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. Abbildung 7. Korrelation und Häufigkeitsverteilung der Unterschiede zwischen den Gefrierpunkt Prozentsätze, gemessen mit automatisierten Systemen und Menschenbeobachtung. (AB) Streudiagramme und Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen Einfrieren Prozent durch automatisierte Systeme und menschliche Beobachtung hat gezeigt. Die Prozentsätze Einfrieren, berechnet mit ImageFZ wurden hoch mit denen durch menschliche Beobachtung erhalten korreliert. (CF) Vorkommen von weniger als 10% verrenz zwischen den Gefrierpunkt Prozentsätze von automatisierten Systemen gegen menschliche Beobachtung erhalten wurden, waren am höchsten, wenn die Daten mit Hilfe ImageFZ wurden mit denen durch menschliche Beobachtung analysiert Vergleich analysiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. ANOVAs Zustand Zeit Zustand x Zeit Tag 1 (Konditionierung) Mensch F (1,8) = 28.53, p = 0,0007 F (7,56) = 20.79, p <0,0001 F (7,56) = 16.58, p <0.0001 ImageFZ F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 F (7,56) = 21.40, p <0,0001 F (7,56) = 11.69, p <0,0001 Freeze-Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 Freeze-Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 F (7,56) = 1,52, p = 0,1803 Freeze-Monitor (Latency3) F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 F (7,56) = 9,94, p <0,0001 F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 Tag 2 (Kontext) Mensch F (1,8) = 42.94, p = 0,0002 F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 F (4,32) = 1,48, p = 0,2302 ImageFZ F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 Freeze-Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 20,28, p = 0,002 F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 Freeze-Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 40.20, p = 0,0002 F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 Freeze-Monitor (Latency3) F (1,8) = 35.30, p = 0,0003 F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 Tabelle 1. Vergleiche von Statistiken.

Discussion

Die inhaltliche und cued Angst Anlage Test ist einer der am häufigsten verwendeten Paradigmen auf Lernen und Gedächtnis zu beurteilen. Dieser Test ist eine Form der Pawlowschen Konditionierung, in der eine Zuordnung zwischen einem Kontext und / oder einem konditionierten Stimulus (Gehör cue) und einem aversiven Reiz (elektrisch Fußschock) gefertigt. Nach noch einer einzigen Paarung der Rahmen / Gehör Cue und Fußschock, Mäuse zeigen langanhaltende Einfrieren wenn sie entweder mit dem Kontext oder Cue konfrontiert. In diesem Test wird die Gefrierverhalten als ein Index der Angst Speicher verwendet. Pharmakologische Untersuchungen und Läsion zeigten, dass die Gedächtnisbildung, Konsolidierung und Retrieval von mehreren Hirnregionen, wie der Amygdala, Hippocampus und präfrontalen Kortex 3,33-35 geregelt. Darüber hinaus haben die Molekulargenetik Studien die Rolle von spezifischen Genen und Molekülen in Lernen und Gedächtnis in diesen Hirnregionen mit gentechnisch veränderten Mäusen 36 beteiligt demonstriert. Daher ist dieser Test Simple und nützlich für die Erkundung der neurobiologischen Grundlagen zugrunde liegende Angst Lernen und Gedächtnis. In diesem Film Artikel, unserem Protokoll haben wir zu Experimentatoren mit detaillierten Informationen zu verstehen und einfach den Test durchführen zu liefern.

Gefrierverhalten wurde durch direkte Beobachtung durch menschliche Experimentatoren quantifiziert. Eine gut ausgebildete Experimentator wird erwartet, zuverlässige, stabile Ergebnisse über Beobachtungen zu produzieren. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren potentielle Probleme, wie Unterschiede in der Beobachtungsmethode, Beobachter spannt und einfache Quantifizierung Fehler macht es schwierig, direkt vergleichen die Ergebnisse von unabhängigen Experimentatoren und verschiedenen Labors. Eine automatisierte Lichtstrahl-Computer Messsystem wurde verwendet, 26,30-32. Allerdings stellt dieses System auch mögliche Probleme bei der Messung Einfrieren Verhaltensweisen. Da der Sensoranordnung kann dieses System nicht in der Lage sein, kleine Kopfbewegungen, die Typica würde erkennenlly als "aktiv" durch die menschliche Beobachtung erzielt werden. Außerdem Zittern während Einfrieren könnte als frostsicher, weil, wenn ein Tier friert, intermittierende Unterbrechungen in der photobeam sind als Folge der zitternden beobachtet berücksichtigt werden. Als ein alternatives Verfahren, wurden automatisierte Bild-und Video-Analysesysteme entwickelt 17-20,37,38. 37 beschrieben, ein paar Systeme mit Bildanalyse-Software-Programme, die gut Gültigkeit haben und Gäste Einfrieren gut 17,20,37-38 Anagnostaras et al.. Allerdings haben die meisten dieser Systeme und Programme zur Analyse von gewerblichen Lieferanten erhalten werden und sind in der Regel teuer. Wir entwickelten die ImageFZ Software-Programm für die Analyse von Gefrierverhalten, und dieses Programm ist als kostenloser Software-Programm verteilt. ImageFZ erkennt die Maus als ein Körper von Pixeln (a-Teilchen) und unterscheidet, subtile Mausbewegung "Einfrieren" oder "nicht-einfrieren" in Abhängigkeit von der Menge derBereich der überlappenden Bereichen zwischen den Teilchen von jedem Paar von aufeinanderfolgenden Bildern. Wie in den repräsentativen Ergebnisse zeigen, sind Messungen mit dem Programm im Einklang mit ImageFZ oder genauer als mit anderen Methoden erhalten. So misst der ImageFZ Programm automatisch das Verhalten, dass menschliche Beobachter das Einfrieren anhand definierter Kriterien beurteilen. Darüber hinaus berechnet die ImageFZ Programm die Wegstrecke (cm) vor, während und nach dem Fußschock Belichtung erleichtert eine Beurteilung der Schockempfindlichkeit und Analyse der Gefrierverhalten.

Methodische Unterschiede bestehen zwischen den Laboratorien. Diese Unterschiede können zu Schwierigkeiten beim Vergleich der Daten zwischen den Labors und in replizieren Ergebnisse in verschiedenen Labors führen. Stabilere und vergleichbare Daten zu erhalten, ist es erforderlich, das Testprotokoll so viel wie möglich zu standardisieren. Das Analysesystem mit ImageFZ führt zur Automatisierung von Testverfahren, die dazu beitragen kanndie Standardisierung der Protokolle über Laboratorien.

Mehrere Verhaltensreaktionen muss bei der Analyse der Gefrierverhalten werden. Erstens, wenn die Tiere vor einer furchtbaren Situation, können sie statt der 39 Einfrieren fliehen. Flucht ist einer der Angstreaktionen, und ihr Auftreten wird unterschätzt Angst Speicher führen. Zweitens kann das Einfrieren auf eine allgemeine Aktivität abhängen und das Aktivitätsniveau in Versuchs-und Kontrollmäusen muss untersucht werden. Obwohl zum Beispiel Mäuse, denen der muskarinischen Acetylcholinrezeptor M1 zeigte reduzierte Mengen von Einfrieren im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen zeigten verschiedenen Verhaltenstests, dass die Ergebnisse ihrer Hyperaktivität Phänotyp anstelle ihres Gedächtnisses 18 zurückgeführt werden. ImageFZ berechnet den Abstand (cm) von den Probanden gereist. Die Daten sind zu prüfen, ob Unterschiede in den allgemeinen Aktivitätsniveaus zwischen den Fächern gibt. Wenn es einen Unterschied in der Gruppedie zurückgelegte Strecke, eine mögliche Herangehensweise an das Problem ist zu prüfen, der Abstand während der ersten 2 Minuten des Trainings als Basisaktivität gereist und einen Unterdrückungsverhältnis / (Aktivität während der Baseline-Aktivität während + verwenden (Unterdrückungsverhältnis = (Aktivität während der Tests) Testen)) als Sekundärindex der Angst 17,40. Schließlich kann ein Unterschied in der Schmerzempfindlichkeit und induziert Veränderungen in der Reaktivität mit einer elektrischen Fuß-Schock, falls vorhanden, zu Variationen in Gefrierverhalten führen. ImageFZ berechnet auch die zurückgelegte Wegstrecke (cm) im Detail von 2 Sekunden vor einer Belichtung von 2 sec bis 2 sec Fuß-Schock nach der Belichtung (6 Sekunden), die als Index der Fußschock Empfindlichkeit verwendet werden können.

Video-Analyse-Systeme wurden entwickelt, um die Gefrierverhalten von Albino, schwarz, Agouti zu messen und zu verdünnen braun Mäusen. ImageFZ verwendet eine schwarze Bodenwanne und schwarze Gitter auf weißen Mäusen zu untersuchen (siehe Abbildung 1B). Die schwarzen Gitter werden von Spezi gemacht Verbündeter verarbeiteten Metalle mit beschichteter schwarzer Farbe und eine elektrische Leitfähigkeit ähnlich der von den unbeschichteten Metallgittern, die typischerweise für schwarze Mäuse verwendet werden. ImageFZ analysiert auch die Gefrierverhalten bei Ratten und andere Nagetiere durch Anpassungen der Programmparameter. In der aktuellen Version von ImageFZ wird das Verhalten der Person mit einer Videokamera von der oberen Wand, um ein Einfrieren zu analysieren aufgezeichnet. ImageFZ könnte auch in einem Set-up, wo die Bilder von der Seite der Kammer eingefangen werden. Darüber hinaus steuert die ImageFZ maximal 4 Vorrichtungen. Diese Funktion ermöglicht es dem Forscher, gleichzeitig untersuchen 4 Mäuse, spart Zeit und reduziert die möglichen Einflüsse aus Unterschieden in der Ausführungszeit jedes Thema und die Prüfung, um auf das Verhalten. Somit ImageFZ vereinfacht das Testverfahren und die Analyse von Gefrierverhalten, und dieses Programm erleichtert Tests mit weniger Arbeit und ohne Ausbildung der Verhaltensexperimenten.

e_content "> In der Miyakawa Labor haben wir mehr als 110 Stämme von gentechnisch veränderten Mäusen und Wildtyp-Kontroll-Mäusen in der Kontext-und cued Angst Anlage Test mit der Videoanalysesystem, um die Auswirkungen eines bestimmten Gens auf Lernen und Gedächtnis aufzuklären bewertet 41-42 Wir haben eine große Menge von Rohdaten für mehr als 5.000 Mäusen erhalten die Rohdaten, die für veröffentlichte wissenschaftliche Artikel 4-16 verwendet wurde, sind in der 'Maus Phänotyp Datenbank' als einer öffentlichen Datenbank (URL enthalten:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Die vorliegende Film Artikel enthält detaillierte Informationen über die Details unserer experimentellen Verfahren und fördert das Verständnis für die Testsituation.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Einige der hier gezeigten Daten wurden im Labor von Dr. Jacqueline N. Crawley in der US-amerikanischen National Institute of Mental Health erhalten und wir würden sie gerne für die Erlaubnis, die Daten in dem Papier zeigen, danken. Wir danken auch Kazuo Nakanishi für seine Hilfe bei der Entwicklung ImageFZ-Programm für Verhaltensanalyse. Diese Forschung wurde unterstützt von Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (21300121), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Anlagen (Comprehensive Brain Science Network) aus dem Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur Japans Finanzhilfe aus Neuro Japan Center (NIJC) und Zuschüsse von CREST von Japan Science and Technology Agency (JST).

Materials

 ImageFZ  program Developed by Tsuyoshi Miyakawa  This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. 
Conditioning chamber O'Hara & co., Japan CL-3002L For mouse.
Cued test chamber O'Hara & co., Japan CLT-3002L For mouse.
Interface O'Hara & co., Japan CL-1040 The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator O'Hara & co., Japan SGA-2040 The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter) O'Hara & co., Japan SG-T
USB video capture device XLR8 USB2IVOSX
Quad image splitter Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan 400AS
Soundproof room O'Hara & co., Japan CL-4210
Freeze Monitor San Diego Instruments, Inc., CA, USA 16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)
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Contextual And Cued Fear ConditioningVideo Analysis SystemImageFZBehavioral TestFreezing BehaviorC57BL/6J MicePhotobeam-based SystemHuman Observer

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Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. J. Vis. Exp. (85), e50871, doi:10.3791/50871 (2014).
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