Farelerde Video Analiz Sistemi kullanma ve bağlamsal cued Korku Klima Testi
Summary
Bu makalede, farelerde öğrenme korku ve belleği değerlendirmek için bir video analiz sistemi kullanılarak bir bağlamsal ve cued korku klima testi için bir protokol sunuyor.
Abstract
Bağlamsal ve cued korku klima testi öğrenmek ve çevresel ipuçları ve caydırıcı deneyimleri arasında bir ilişki hatırlamak için farelerin yeteneğini değerlendirir davranışsal testlerden biridir. Bu testte, fareler, bir klima odasına yerleştirilir ve klimalı bir uyarıcı (işitsel bir işaret) ve kırpıntı ve caydırıcı bir koşulsuz uyarıcı (bir elektrik ayak şoku) verilmiştir. Bir gecikme süresinden sonra, fareler aynı klima odası ile işaret işitsel sunumu ile farklı şekil verilmiş bir bölmesine maruz kalmaktadır. Donma davranışı test sırasında korku bellek bir indeksi olarak ölçülür. Otomatik olarak davranışlarını analiz etmek, biz http://www.mouse-phenotype.org/ adresinden ücretsiz olarak kullanılabilir ImageFZ uygulama yazılım programı kullanarak video analiz sistemi geliştirdik. İşte, bizim protokol ayrıntılarını göstermek için, biz bağlamsal için prosedür göstermek ve ImageFZ Sist kullanarak C57BL/6J farelerde korku klima testi cuedem. Ayrıca, bizim protokol ve bir insan gözlemci tarafından atılırsa o ile ImageFZ sistemi veya bir photobeam-tabanlı bir bilgisayar ölçüm sistemi tarafından ölçülen dondurma karşılaştırarak zaman video analiz sistem performansını valide. Bizim için temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, ImageFZ ile elde edilen veriler, ImageFZ sistemi kullanılarak davranış analizi son derece güvenilir olduğunu gösteren, bir insan gözlemci ile analiz edilenlere benzerdi. Mevcut film makale test prosedürleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar ve deneysel durumun anlaşılmasını teşvik edecektir.
Introduction
Bağlamsal ve cued korku klima testi kemirgenlerde 1-3 ilişkisel öğrenme korku ve belleği değerlendirmek için kullanılan davranışsal paradigma. Bu test yaygın olarak transgenik ve nakavt farelerde 1,4-16 korku öğrenme ve bellek nörobiyolojik mekanizmaları anlamak için kullanılır olmuştur. Nefes hariç tam hareketsizlik gibi tanımlanmıştır Donma davranışı, korku durumları için ortak bir tepkidir. Hayvanlar bir elektirik ayak şoku olan bir işitsel bir işaret eşleştirme maruz sonra bu davranış paradigmada, bu birleştirici korku öğrenme ve bellek indeksi olarak ölçülür donma davranışı göstererek korku üreten uyarana yanıt verir. Bu test daha ayrıntılı ekipman, araştırmacı tarafından daha az fiziksel efor ve diğer öğrenme ve hafıza görevleri daha fareler için çok daha az eğitim zaman gerektirir; genellikle 2 gün boyunca yaklaşık 5-10 dk / gün fare başına gerektirir. Test prosedürü si olmasına rağmenmple ve gerçekleştirmek için çok az zaman gerektirir, araştırmacı dikkatle gözlemlemek ve fare davranışı ölçmek gerekir, bu nedenle, birçok otomatik ölçüm sistemleri davranışsal analizi 17-20 yapmak için geliştirilmiştir. Biz ImageFZ yazılım programı ile geliştirilen Bizim video-analiz sistemi, bize kolayca donma davranışlarını analiz ve son derece güvenilir sonuçlar üretmek için izin verir. Bu makale, test prosedürü hakkında ayrıntılı bilgi sağlar ve ImageFZ yazılım programı için nasıl kullanılacağı açıklanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağlamsal ve cued korku klima testi öğrenme ve hafıza değerlendirmek için en yaygın kullanılan paradigmaların biridir. Bu test, bir dernek, bir bağlam ve / veya şartlı uyaran (işitsel işaret) ve caydırıcı bir uyarıcı (elektrik footshock) arasında yapılmış olduğu Pavlovyan klima şeklidir. Bağlam veya işaret ya ile karşı karşıya bağlam / işitsel işaret ve Ayak şokunun bile tek bir eşleşmeden sonra, fareler uzun ömürlü donmasını sergilerler. Bu testte, donma davranışı korku bellek bir göstergesi olarak kullanılır. Farmakolojik ve lezyon çalışmaları hafıza oluşumu, konsolidasyon ve geri alma gibi amigdala, hipokampus ve prefrontal korteks 3,33-35 gibi çeşitli beyin bölgeleri tarafından düzenlenmektedir ortaya koymuştur. Buna ek olarak, moleküler genetik çalışmalar, spesifik genlerin ve genetik olarak fareler 36 kullanılarak bu beyin bölgelerinde öğrenme ve hafıza ile ilgili moleküllerin bir rol oynadığım göstermiştir. Bu nedenle, bu test simple ve nörobiyolojik temeli yatan korku, öğrenme ve hafıza keşfetmek için yararlıdır. Bu film yazıda, anlamak ve kolayca testi gerçekleştirmek için ayrıntılı bilgi denemeyen sağlamak için bizim protokol tanıttı.
Donma davranışı insan deneyciler tarafından doğrudan gözlem yoluyla ölçüldü. İyi eğitilmiş deneyci gözlemler karşısında güvenilir, istikrarlı sonuçlar üretmesi bekleniyor. Ancak, bu yöntem gibi gözlemsel yöntemi farklılığa, gözlemci önyargıları ve basit ölçümü hatalar gibi potansiyel sorunları, zor doğrudan bağımsız deneyci ve farklı laboratuvarların sonuçları karşılaştırmak yapılmasını gerektirir. Otomatik bir photobeam-tabanlı bilgisayar ölçüm sistemi de 26,30-32 kullanılmıştır. Ancak bu sistem, aynı zamanda donma davranışı ölçme potansiyel sorunlar çıkarmaktadır. Çünkü sensör düzenlemenin, bu sistem Typica olurdu küçük baş hareketleri algılamak mümkün olabilirLly insan gözlem yoluyla 'aktif' olarak atılır. Buna ek olarak, donma sırasında titreyen bir hayvan donuyor, photobeam aralıklı kesintiler titreyen bir sonucu olarak görülmektedir, çünkü, donmanın olarak düşünülebilir. Alternatif bir yöntem olarak, otomatik bir görüntü ve video analiz sistemleri, 17-20,37,38 geliştirilmiştir. Anagnostaras vd. 37 iyi geçerliliğe sahip ve iyi 17,20,37-38 dondurma puan görüntü analiz yazılımı programları ile birkaç sistem nitelendirdi. Ancak, bu sistemler ve analiz programları çoğu ticari tedarikçilerden elde edilecek ve tipik olarak maliyetlidir. Biz dondurma davranış analizi için ImageFZ yazılım programı geliştirdi ve bu program ücretsiz bir yazılım programı olarak dağıtılmaktadır. ImageFZ piksel bir gövde (parçacık) olarak fare algılar ve miktarı bağlı olarak dondurma 'veya' non-dondurma 'olarak ince fare hareketi ayrımcılıkardışık görüntülerin her biri bir parçacık arasındaki örtüşmeyen bölgelerin alan. Temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, ImageFZ programı kullanılarak ölçümler ile tutarlı veya başka yöntemler kullanılarak elde edilen çok daha doğrudur. Böylece, ImageFZ program otomatik olarak insan gözlemciler tanımlı kriterleri kullanarak dondurma gibi hakim olduğu davranışı ölçer. Buna ek olarak, ImageFZ programı mesafe sırasında, daha önce (cm) gitti ve ayak şoku maruz kaldıktan sonra, donma davranışının şok duyarlılık ve analiz bir değerlendirme kolaylaştırmak hesaplar.
Metodolojik farklılıklar laboratuarlar arasında var. Bu farklılıklar, laboratuarlar arasında verilerin karşılaştırılması zorluk ve farklı laboratuarlarda sonuçlar replike neden olabilir. Daha istikrarlı ve karşılaştırılabilir veriler elde etmek için, bu test protokolünü mümkün olduğu kadar standart gereklidir. ImageFZ ile analiz sistemi katkıda bulunabilir test prosedürleri otomasyon yol açarprotokollerinin standardizasyonu laboratuvarlar boyunca kullanılır.
Donma davranışı analiz ederken çeşitli davranışsal tepkileri düşünülmelidir. Hayvanlar korkunç bir durumla karşı karşıya İlk, ne zaman, bunun yerine 39 donma kaçabilsin. Kaçan korku cevaplardan biridir ve onun oluşum korku hafızasını küçümseyen yol açacaktır. İkinci olarak, dondurma genel bir aktivite seviyesine bağlı olabilir ve kontrol ve deney farelerinde aktivite düzeyi muayene edilmesi gerekmektedir. M1 muskarinik asetilkolin reseptörü eksik farenin yabani tip farelere kıyasla dondurma azaltılmış düzeyde gösterdi, ancak, örneğin, çeşitli davranışsal testleri sonuçları yerine kendi hafıza bozukluğu 18 kendi hiperaktivite fenotipi atfedilebilir olabileceğini göstermiştir. ImageFZ konular ile seyahat mesafe (cm) hesaplar. Veri farklılıklar konular arasında genel aktivite düzeyleri mevcut olup olmadığını incelemek için kullanılabilir. Bir grup fark varsamesafe sorunun olası bir yaklaşım mesafesi temel etkinlik olarak eğitimin ilk 2 dakika boyunca gitti düşünün ve sırasında bazal + aktivite sırasında / (aktivite (bastırma oranı = (aktivite test sırasında) bir bastırma oranı kullanmak için, gitti korku 17,40 ikincil bir indeksi olarak test)). Son olarak, bir elektirik ayak şoku için reaktivite açısından değişiklikler indükleyen ağrı hassasiyetinde bir fark, eğer varsa, donma davranışı değişikliklere neden olabilir. ImageFZ da mesafe ayak şoku duyarlılık bir indeksi olarak kullanılabilir (6 saniye) ile maruz kaldıktan sonra 2 saniye için 2 saniye Ayak şokunun bir maruz kalma, daha önce 2 saniye ayrıntılı olarak (cm), seyahat hesaplar.
Video analiz sistemleri, siyah agouti albino, donma davranışı ölçmek ve kahverengi fareler sulandırmak için geliştirilmiştir. ImageFZ (Şekil 1B bakınız) beyaz fareler incelemek için siyah zemin tepsi ve siyah ağlarını kullanır. Siyah ızgaralar speci yapılır ally kaplı siyah boya ile metal işleme ve tipik olarak siyah fareler için kullanılan kaplanmamış metal ızgaralar, benzer bir elektrik iletkenliğine sahiptir. ImageFZ da program parametrelerinin ayarlamaları ile sıçan ve diğer kemirgenlerde donma davranışı analiz eder. ImageFZ güncel versiyonda, konunun donma davranışı analiz etmek için, üst duvardan bir video kamera ile kaydedilir. ImageFZ görüntüleri bölmenin tarafından yakalanır, bir set-up da kullanılabilir. Buna ek olarak, ImageFZ 4 aparatların fazla kontrol eder. Bu özellik, zaman tasarrufu ve her konunun yürütme zamanı ve davranışları üzerinde test sırayla farklılıklardan potansiyel etkilerini azaltarak, araştırmacı aynı anda 4 fareleri incelemek için olanak sağlar. Böylece, ImageFZ test prosedürü ve donma davranış analizini kolaylaştırır, ve bu program daha az emek ve davranışsal deneyler için herhangi bir eğitim olmadan test kolaylaştırır.
Miyakawa Laboratuarda e_content ">, öğrenme ve hafıza ile ilgili belirli bir genin etkisini araştırmak için görüntü analiz sistemi kullanılarak ve bağlamsal korku şartlandırma tetiklenen testte genetik olarak fare ve vahşi tipli kontrol farelerinin fazla 110 suşları değerlendirilmiştir 41-42 Biz 5.000 'den fazla fareler için ham verilerin büyük bir set elde etmiş yayınlanan araştırma makaleleri 4-16 için kullanılan ham verileri bir ortak veritabanı (URL olarak' Fare Fenotip Veritabanı 'dahildir:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Mevcut film makale, deneysel işlemin detayları ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar ve test durumun anlaşılmasını teşvik etmektedir.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada gösterilen bazı verilerin Ruh Sağlığı ABD Ulusal Enstitüsü'nden Dr Jacqueline N. Crawley laboratuvarda elde edildi ve bize kağıt verileri göstermek için izin verdiği için ona teşekkür etmek istiyorum. Biz de davranış analizi için ImageFZ programı geliştirirken yaptığı yardım için Kazuo Nakanishi teşekkür ederim. Bu araştırma ile desteklenen Hibe-in-Aid Bilimsel Araştırma (B) (21.300.121), Grant-in-Aid Bilimsel Araştırma Yenilikçi Alanları Eğitim Bakanlığı (Kapsamlı Beyin Bilim Ağı), Bilim, Spor ve Kültür Japonya üzerinde , Nöroinformatik Japonya Merkezi (NIJC) ve Japonya Bilim ve Teknoloji Kurumu (JST) Crest hibe dan hibe.
Materials
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
Referências
- Crawley, J. N. . What’s wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
