1. Isolamento de células mielóides de tumores de próstata TRAMP Todos os procedimentos foram realizados sob a orientação de um conselho de revisão animal. Ratinhos TRAMP espontaneamente desenvolver tumores de próstata autóctones como resultado de um transgene (SV40), controlada pelo promotor probasin 10. Qualquer rato macho pode ser usado para este procedimento. Enquanto tumores TRAMP pode ser colhido em qualquer idade, deve notar-se que TRAMP tumores de próstata geralmente permanecem pequenas até os ratinhos alcançar idades superiores a 20 semanas. Euthanize camundongos por asfixia CO 2. Remover o tracto urogenital (UGT), por corte aberta da cavidade peritoneal e puxando para trás o tecido adiposo. O tecido adiposo é espuma, tecido brilhante olhar. Localize a bexiga, que está diretamente entre os dois grandes, brancas vesículas seminais. Segure a bexiga com uma pinça. Mantendo a tesoura fechada, alisar o tecido adiposo e localizar a uretra. Diminua a urethra tão perto da cintura pélvica e possível cortar os canais deferentes. Enquanto reduzindo, simultaneamente puxe a bexiga. Isto irá libertar a UGT inteiro que pode agora ser micro-dissecados para se obter cada um dos lóbulos da próstata. Coloque a UGT em temperatura ambiente PBS. Use um microscópio de dissecação para visualizar a UGT e limpar qualquer excesso de tecido adiposo. Usando uma pinça, segure a uretra e recolher os lobos ventral, lateral e anterior da próstata. Colocar o tecido em PBS durante a recolher o resto dos lóbulos. Remover das vesículas seminais e descartar. Gire o restante tecido 180 °. Colete a glândula ampular e lobos da próstata dorsal. Usando uma pinça, desmembrar o tecido da próstata e colocá-lo na digestão (dissociação) buffer. Tecido local do tumor em 1 ml de tampão de dissociação (100 U / ml de colagenase tipo IV e 100 ug / ml de DNase em RPMI + FBS 10%). Cada tumor de Maio de requcondições ire únicas de dissociação; para TRAMP tumores de próstata, usar 1 ml e para B16 tumores, utilizar 5 ml (ver abaixo). Nota: o grau de colagenase (I-IV) dependerá da população de células a ser isolado, isolamento de células mielóides é melhor com o tipo IV, enquanto o rendimento de linfócitos é maior usando tipo I. Colocar o tubo em 37 ° C incubadora durante 30 min. Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 1 ml para obter uma suspensão de células facilmente fluindo único. Filtrar através de suspensão 70 micron filtro e lavar 3x com tampão de separação MACs suplementado com FBS 10% para o isolamento de células mielóides. Centrifugar a suspensão de células a 400 xg durante 10 min. Em seguida, lavar o pellet com 10 ml de tampão MACs e centrifugar novamente com as mesmas configurações. Ressuspender o pellet celular em 100 ul de tampão MACs. Em seguida, adicionar 1 ug anti-CD16/32 anticorpo (Ab) por 10 8 células (200 uL 2.4.G2 cultura sobrenadante de hibridoma) e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Nota: tele quantidade de FcR-γ bloqueio anticorpo (Ab) a ser adicionado pode variar dependendo das frequências / número de FcR-y + de células no tecido eo volume da suspensão de células e, portanto, este passo pode requerer optimização. Adicionar 100 ul de "Pan-DC" ou 10 ul de anti-CD11b, anti-CD11c ou anti-PDCA-1 micropérolas por 10 8 células totais, dependendo da população de células desejada. Nota: a quantidade de micro-esferas necessários podem variar dependendo da frequência / número de células da população desejada no tecido e, portanto, este passo pode requerer optimização. Misturar bem suavemente flicking tubo (Não Vortex) e incubar durante 15 min a 4-8 ° C, protegidos da luz. Não incubar em gelo. Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACs. Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Escorrer completamente o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão MACs. Suspensões de células tumorais fluir melhor através das colunas LC. (Outroopções: MS, LS, LD). Aplicar uma coluna fresco para o separador de magneto. Primeiro a coluna por lavagem com uma quantidade apropriada de tampão de MACs para a coluna seleccionada: Para LC e colunas MS usar 500 uL. Para LS ou LD colunas utilizar 1 ml. Após o condicionamento da coluna, aplicam-se suspensão de células para o topo da coluna. Use uma coluna para cada 1 x 10 8 células. Recolher células não marcado (passagem) e lavar a coluna de um mínimo de três (até cinco) vezes com 500 uL de volume para um total de 1,5-2,5 ml de lavagem de fluido. Realizar o passo de lavagem 1 por adição de tampão de MACs para a coluna, é importante manter a coluna de fluir. Logo que a coluna goteja a última gota, adicionar mais tampão. Não deixe que a coluna sem fluxo ou deixe-a secar (esse não pode ser subestimado, como a secagem da coluna pode arruinar pureza e levar à perda significativa de viabilidade celular.). Para a etapa de lavagem 2, lavar a coluna com dissociação mistura tampão (contendo colagenase + DNase como dedescrito no passo 1.7), o que serve como uma etapa de lavagem "mais duro" para expulsar os detritos pegajoso de mortos ou moribundos células tumorais. Realizar o passo de lavagem com tampão de 3 MACs; se o fluxo através de não parece completamente claro após o passo de lavagem 3, continuar a lavar durante 2 passos de lavagem adicionais com MACs tampão (para um total de 5 lavagens). Para grandes tumores subcutâneos (por exemplo, melanoma B16), durante o passo de última lavagem, aplicam uma pressão suave com a ponta do dedo enluvado para o topo da coluna, o que liberta os detritos extra para um líquido de limpeza, purificado população de células. Este passo não é necessário para os tumores sólidos, tais como tecidos da próstata, em vez disso, utilizar as etapas de lavagem extra, lavagem um total de pelo menos 5-6 vezes. Remover a partir da coluna de separação magnética e colocá-lo em um tubo de recolha adequado. Pipeta de 2 ml de tampão para a coluna. Recolher as células magneticamente marcadas por firmemente aplicando o êmbolo fornecido com a coluna. Conte o número de células e confirmar a pureza para a população de células selecionadoanálise de fluxo citométrico. Para a identificação de populações de corrente contínua, marcadores sugeridos incluem CD45, CD11c, PDCA-1, B220 e CD11b. Marcadores de macrófagos sugeridas incluem CD45, CD11b, F4-80, e Ly6C. 2. Isolamento de adotivamente transferidos células T a partir de tumores de melanoma B16 subcutâneas Este protocolo funciona melhor com tumores que são 250 milímetros ou menos 2 (estimada pela medição diâmetros bissectriz do tumor). B16 células tumorais foram injectados subcutaneamente em ratinhos C57BL / 6 e as medições do tumor foram registadas a cada 2 dias 8. Os ratos com tumores medindo 250 mm 2 são sacrificados por asfixia CO 2. Usando autoclavados instrumentos cirúrgicos lavadas com ETOH a 70%, cortados em pequenos tumor (<3mm) pedaços e incubar em 5 ml de dissociação solução (meio RPMI suplementado com 5% de FBS, colagenase tipo I (200 U / ml) e ADNase I (100 ug / ml)) durante 30 min a 37 ° C, de pipetagem (usando um μ 1000ponta de pipeta l) e vortex a cada 10 minutos durante a incubação. Se as células mielóides irá ser subsequentemente isolado, substituir 5% de FBS e colagenase tipo I, com 10% de FBS e colagenase tipo IV (200 U / ml), respectivamente. Após a incubação, passar suspensão de células através de um filtro de células 70 uM e lavar duas vezes com 10 ml MACs tampão (preparada de acordo com as instruções do fabricante, Miltenyi Biotech). Opcional – para tumores muito grandes (> 300 mm 2), as células inflamatórias pode ser pré-enriquecido utilizando centrifugação em gradiente de densidade (Percoll ou Ficoll). Aspirar o sobrenadante de lavagem e adicionar 1 ug anti-CD16/32 antibody/10 8 células (200 uL de sobrenadante de cultura do clone 2.4.G2) e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Sem lavagem, adicionar 1 ug de anticorpo anti-Thy1.1 PE por cada 10 8 células, misturar bem, por suavemente sacudindo o tubo e incubar durante 30 minutos em gelo, protegidos da luz. Lave as células para remover desacoplado priMaria anticorpo por adição de 10 ml de tampão de MACs e centrifugação a 400 xg durante 5 minutos. Aspirar o sobrenadante e adicionar 20 uL anti-PE micropérolas (Miltenyi Biotech) por 10 7 células totais, de acordo com as instruções do fabricante. Misturar bem suavemente flicking tubo (não vórtice) e incubar a 4 ° C (não usar gelo) durante 15 minutos, protegidos da luz. Cuidado: vórtex pode diminuir a integridade dos grânulos. Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACs e centrifugar a 400 xg durante 5 minutos. Aspirar células sobrenadante, e ressuspender em 500 de tampão MACs uL. Para os tumores de maior dimensão (> 300 mm 2), use 1 ml de tampão. O local de uma LC coluna (de grandes células) no separador de campo magnético. As suspensões de células tumorais melhor fluir através destas colunas. Lavar a coluna com 500 uL de tampão MACs para escorvar a coluna. A maioria dos tumores também vai fluir através de LS e colunas LD, mas requerem mais digestão e mecânica disruption para atingir o nível apropriado de suspensão de células individuais. Lavar a coluna com um tampão de MACs ml para preparar a coluna. Aplicar suspensão de células para a coluna e deixa-se fluir através completamente (sem deixar que a execução de coluna seca). Em seguida, lave com 500 ul de tampão MACs, e repetir a lavagem 3x. Só adicionar novo buffer quando o reservatório está vazio coluna, mas não deixe a coluna ficar sem fluxo. Isto fará com que o entupimento ea pureza diminuída. Este é um passo crítico para grandes tumores subcutâneos: Após o passo de última lavagem, com uma ponta do dedo enluvado, aplicar uma pressão suave para o topo da coluna, enquanto ainda no separador magnético. Isso libera os detritos extra para uma população mais puramente enriquecido. Em seguida, lavar a coluna 1 mais tempo com 500 uL de tampão MACs. Remover coluna a partir do separador e colocá-lo em um tubo limpo 15 ml cónico, adicionar 2 ml de tampão de MACs na coluna. Lave o cel magneticamente marcadols por empurrando o êmbolo para dentro da coluna. Centrifugar a fracção eluída a 400 xg durante 5 min. Pureza neste passo é tipicamente entre 75-80%. Para alcançar> pureza 90%, repetir o procedimento de separação magnética, tal como descrito no passo 1,10-1,12 utilizando uma coluna MS novo. A coluna MS é menor e mais compacto de modo a suspensão irão rodar mais lentamente através da coluna, mas irá produzir números mais elevados de pureza e de uma célula de interesse. Contar o número de células para novas experiências e verificar a pureza através da análise por citometria de fluxo. Para o isolamento de adotivamente transferidos células T tais como os descritos neste protocolo, os marcadores de alélicas para a identificação incluem CD45 e Thy1.1 (células transferidos) e Thy1.2 (células T do hospedeiro). 3. Os resultados representativos O rendimento de uma população de células em particular (isto é, macrófagos, células T DC, etc) irá variar dependendo do tamanho do tumor e tratamentos que eram de administraçãoistered durante o crescimento do tumor. A próstata a partir de um rato 14-16 semanas de idade não tratada TRAMP deve render entre 8×10 5-1×10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC), as células em pureza de 90-95% ou 1×10 6-1.5×10 6 F4/80 + / CD11b + (macrófagos) com pureza de 80-90% a partir de 300 mg de tecido, seguindo o protocolo de isolamento acima, como mostrado na Figura 1. O número de cada uma destas células aumenta ligeiramente a transferência adoptiva de tumor de antigénios de células T específicas. Pureza pobre é geralmente um resultado da lavagem insuficiente, permitindo que a coluna para secar (o que pode resultar na retenção de detritos tumor na coluna), ou receptor Fc insuficiente de bloqueio. Do mesmo modo, as células total isolado a partir de tumores B16 também irá variar dependendo do tamanho do tumor no momento da colheita de tecidos e transferência adoptiva de células T (transferência de 5×10 6), com ou sem a vacina DC (transferência de 1×10 5). Muito poucos antígeno espe-As células T específicos do tumor, a menos que se infiltrar um antigénio-pulsada DC vacina também é dada um dia após a transferência de células T. Se uma vacina DC é administrada a um rato que ostenta uma pequena, do tumor (<50 mm 2) palpável, com um rendimento de cerca de 3×10 5 Thy1.1 + células T, com uma pureza de 80-85%, seria considerado uma boa " "colheita, como mostrado na Figura 2A. No entanto, se tumores maiores são colhidas, o rendimento total e pureza será reduzida. Macrófagos (F4/80 + / CD11b +) são geralmente uma menor percentagem do total de células em B16 tumores. Figura 2B mostra que utilizando CD11b, a partir de um tumor que é de 250 mm 2, rende aproximadamente 1×10 6 macrófagos em pureza de 90-95% . Além disso, a Figura 2B mostra que a população em DC B16 tumores são heterogéneos. Ao contrário dos tumores de próstata, duas subpopulações: CD11c + / PDCA-1 + (plasmocitóide DC) e CD11c+ / PDCA-1 – (DC convencional) pode ser obtido a partir de tumores de melanoma B16. Estima-se que 2×10 6 e 4×10 6 pDC CDC são esperados a partir de 2 B16 250 mm tumores na pureza de 80-90%. Pureza reduzido é geralmente um resultado de não limpar as células de tumores da coluna. Passo 2,12 é um passo crítico para remover o pequeno grupo de células de melanoma que persiste na base da coluna. Após este passo melhora a eficácia dos passos de lavagem e resulta em melhor pureza. Figura 1. DCS (CD11c + / PDCA-1 +) e macrófagos (F4/80 + / CD11b +) foram isoladas a partir de um tumor de próstata TRAMP. Valores gráfico de pontos representam a porcentagem de células de interesse pré-ou pós-purificação. Figura 2. (A) Adoptively transferido Thy1.1 + / CD8 + e (B), incluindo células mielóides CD11c + / PDCA-1 + plasmocitóides DCs, CD11c + / PDCA-1 – DCs convencionais e F4/80 + / CD11b + de macrófagos foram isolados a partir subcutânea B16 tumor de melanoma a partir de ratinhos Thy1.2 A +. Valores gráfico de pontos representam a porcentagem de células de interesse pré-ou pós-purificação.