本稿では、腫瘍に浸潤する白血球の高度に精製された集団を単離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは複雑な腫瘍組織から細胞を単離するための収率および純度を高めるためにミルテニーバイオテクプロトコルから構成されている。
白血球は、様々なケモカインおよび増殖因子1,2によって腫瘍に補充されることにより腫瘍が固有の免疫微小環境(腫瘍微小環境、TME)を作成します。しかし、一度TMEで、これらの細胞は、抗腫瘍免疫を促進し、腫瘍の成長をサポートすると3-4抗腫瘍免疫応答をダウンレギュレートを開始する能力を失う。腫瘍関連白血球に関する研究は主に、原発腫瘍から十分な細胞数と純度を得ることの困難さに起因する腫瘍所属リンパ節または脾臓から単離された細胞に焦点を当てている。担癌マウスのリンパ系を介して細胞の活性化と人身売買のメカニズムを識別することが重要であると、癌に対する免疫応答の動態に洞察力を与えるかもしれないが、我々の経験では、樹状細胞(DC)を含む多くの白血球は、腫瘍排水リンパ節腫瘍5,6を浸透させるものとは異なる表現型を有する。さらに、我々は以前から単離したT細胞を養子転送さことが示されている腫瘍所属リンパ節がtolerizedとtolerizedと増殖やサイトカインが不可能であるTMEから単離したT細胞とは異なり、in vitroでの二次刺激に応答することができますされていません生産7,8。興味深いことに、我々はこのような養子免疫伝達を介してCD4 +ヘルパーT細胞を提供するものとして、腫瘍の微小環境を変更することが示されている、CD8を促進する+プロ炎症性エフェクター機能5を維持するためにT細胞を。前述の研究のそれぞれの結果から、周辺に残っている細胞とは対照的に、TME浸潤免疫細胞から細胞応答を測定することの重要性を示しています。ミルテニーバイオ分離システム9を使用して腫瘍に浸潤する免疫細胞の機能を研究するために、我々は非常に電子メールを取得するには、この抗体ベースの分離手順を変更し、最適化した抗原提示細胞と腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球のnriched集団。プロトコルは、自発的前立腺腫瘍モデル(トランスジェニックマウスの腺癌前立腺TRAMP)10および皮下黒色腫(B16)は、様々な白血球集団のその後の精製に続いて腫瘍モデルからマウス前立腺組織の詳細な解剖が含まれています。
このプロトコルは、腫瘍の大きさとソース(皮下、自発的な腫瘍、または同所性腫瘍)に基づいて、変更することができます。大きな腫瘍では、それが解離バッファーの量は、MACのバッファ、および洗浄の回数を増やすことをお勧めします。単離された細胞の誠実さは、それらが豊かにされて、そこからTMEに依存することができます。例えば、我々の経験では、自発的前立腺腫瘍から単離された細胞は、皮下B16メラノーマ腫瘍から単離された細胞よりも緩やか解離する必要があります。腫瘍の解剖時には、多くの脂肪、皮膚、または効果的な酵素の解離を防ぐことができ、他の破片のように排除します。それは完全に腫瘍塊を消化し、適切な抗体のラベリングを確保し、目詰まりから列を防ぐために、単一細胞懸濁液を得ることが重要です。骨髄細胞を分離するために、MACの分離バッファで推奨されているウシ胎児血清の量は、細胞の生存を改善するために2%から10%に増加した。また、ESSEです。非特異的抗体が結合し、カラムの目詰まりを防止するためのプロトコルを通して冷たいすべてのバッファおよび細胞を維持するntial。結論としては、抗原提示細胞と腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球の高濃縮集団を得るために、我々は、ミルテニーバイオ技術を利用した抗体ベースの分離手順を変更し、最適化されています。このプロトコルを利用して、両方の養子転送され、内因性の白血球集団は、細胞型特異的表面マーカーに対して向けられたABS樹脂を使用して濃縮されることがあります。説明する手順の一つの利点は、腫瘍の破片の削減広範かつ厳格な洗浄後のキャリーオーバーである。これは、腫瘍細胞によるカラムの目詰まりをなくすことができ、洗浄緩衝液のコラゲナーゼの使用だけでなく、カラムに圧力を加えた時点の識別が含まれています。特に機能解析に適した純度で、組織から免疫細胞の十分な数を取得し、困難な作業になることがあります。しかし、我々の経験では、プロトコルは、本明細書で最も一貫して、最大の純度で、セルの最大数を得られます。
The authors have nothing to disclose.
著者は、原稿とビデオのレビューのために博士スコットダラムに感謝します。この作品は、NIH、NCIの学内研究プログラムにより、一部でサポートされています。
Reagent | Company | Catalouge Number | Comments |
Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Use for myeloid selection |
DNase | Calbiochem | 260913 | |
RPMI | Gibco | 21870 | |
Dulbecco’s PBS | Lonza | 17-5158 | |
Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
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Thy1.1 PE | ebioscience | 551401 | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-294 | |
Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotech | 120-003-183 | |
Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-300 | |
LC column | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | |
MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 |