1. 계집 전립선 종양에서 골수양 세포의 분리 모든 절차는 동물 검토위원회의지도하에 수행되었다. 계집 생쥐는 자발적 probasin업자 10에 의해 통제 transgene (SV40)의 결과로 autochthonous 전립선 종양을 개발합니다. 모든 남성 마우스가이 절차를 사용할 수 있습니다. 계집 종양이 어느 나이에 수확 수 있지만, 그것은 생쥐 20 주 이상 연령대가보다 도달할 때까지 계집 전립선 종양은 일반적으로 소형 남아 있다고 지적한다. CO 2 질식하여 쥐를 안락사시켜야. 복막 캐비티를 열고 절단하고 지방 조직을 후퇴하여 urogenital 요로 (UGT)를 제거합니다. 지방 조직은 거품, 반짝 이는보고 조직이다. 방광을 찾아, 그것은 두 개의 커다란, 흰 정액 vesicles간에 직접 자리잡고 있습니다. 포셉과 방광에 만요. 유지 가위는 지방 조직을 떠나 부드럽고 요도를 찾은 마감했다. U 줄이려고가능한 한 골반 환상 골 가까이로 rethra 및 중이야의 정관을 끊을. 자르고있는 동안 동시에 방광에 올려. 이것은 지금은 전립선의 엽 (叶) 각을 얻기 위해 마이크로 해부 될 수 있습니다 전체 UGT를 발표할 예정이다. 방 온도 PBS에서 UGT를 놓습니다. UGT을 시각화하고 과도한 지방 조직을 떠나 취소 해부 현미경을 사용합니다. 집게를 사용하여 요도를 지키고과 전립선의, 복부 측면과 앞부분 엽 (叶)을 수집합니다. 당신 엽 (叶)의 나머지를 수집하는 동안 PBS에서 조직을 놓습니다. 정액 vesicles를 제거하고 폐기. 남은 티슈 180 °를 돌립니다. ampullary 글랜드 및 지느러미 전립선 엽 (叶)을 수집합니다. 집게를 사용하여 전립선 조직을 분열 애타게하고 소화 (분해) 버퍼에 넣습니다. 한 ML 분리 버퍼 (100 U / ML Collagenase 유형 IV 및 RPMI + 10% FBS 100 μg / ML DNase)의 장소 종양 조직. 각각의 종양 월 requ분노 고유한 분리 조건은, 계집 전립선 종양에 대해, 1 ML을 사용 B16 종양 들면, (아래) 5 ML을 사용합니다. 참고 : Collagenase (I-IV)의 등급 고립된 것으로 세포 인구에 따라 달라집니다, 림프구 수율 입력 난을 사용하여 높은 반면 골수양 세포 격리는, 유형 IV에 가장 적합 37의 장소 튜브 30 분 대한 ° C 배양기. 쉽게 흐르는 단일 세포 현탁액을 위해 1 ML 피펫으로 위아래로 피펫. 필터 70 미크론 필터를 통해 서스펜션과 골수양 세포 격리 10 % FBS와 보충 맥에서 분리 완충액으로 3 배 씻는다. 10 분 400 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 그렇다면 10 ML 맥을 버퍼와 펠렛을 씻어 동일한 설정으로 다시 원심 분리기. 100 μl 맥에서 버퍼에 세포 펠렛을 Resuspend. 다음으로, 10 8 셀 (200 μl 2.4.G2 하이 브리 도마 문화 뜨는) 당 1 μg anti-CD16/32 항체 (AB)를 추가하고 10 분 동안 상온에서 품어. 참고 : T그는 추가되는 FcR-γ 차단 항체 (AB)의 양은 조직의 주파수 / 횟수 FcR-γ + 세포와 세포 현탁액의 볼륨에 따라 다를 수 있으므로이 단계는 최적화가 필요할 수 있습니다. "팬-DC"100 μl 또는 안티 CD11b, 안티 CD11c 또는 방지 PDCA-1 원하는 세포 인구에 따라 10 8 합계 셀 당 MicroBeads. 10 μl를 추가하십시오 참고 : 필요한 MicroBeads의 금액 조직에서 원하는 인구의 세포의 빈도 / 수를 따라 달라질 수 있으며, 따라서이 단계에서 최적화가 필요할 수 있습니다. 부드럽게 튜브 (소용돌이하지 않음) flicking에 의해 잘 섞어서 빛으로부터 차폐 4-8 ° C에서 15 분, 위해 알을 품다. 빙판에 부화하지 마십시오. 맥에서 버퍼 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 붓고 맥 버퍼 500 μl의 세포를 resuspend. 종양 세포 현탁액은 LC 컬럼을 통해 더 흘러. (다른선택 : MS, LS, LD). 자석 분리기에 새로운 컬럼을 적용합니다. 프라임은 선택한 열에서 Mac 용 버퍼의 적절한 금액으로 rinsing에 의한 칼럼 : LC와 MS 열을는 500 μl를 사용합니다. LS 혹은 LD에 대한 열이 1 ML을 사용합니다. 마중물 칼럼 후, 열 상단에 세포 현탁액을 적용합니다. 매 1 X 10 8 세포에 대해 하나의 컬럼을 사용합니다. 레이블이 지정되지 않은 세포를 (통과)를 수집 및 유체 세척 1.5-2.5 ML 총 500 μl 볼륨과 열의 세 (최대 5) 시대의 최소 씻는다. 칼럼에 맥을 버퍼를 추가하여 1 단계를 씻어 수행, 그것은 열이 흐르는 유지하는 것이 중요합니다. 즉시 열이 마지막 한 방울까지 drips로 더 많은 버퍼를 추가합니다. 유동없이 열 이러고하거나 (이것은 순결을 망치와 세포 생존 능력의 상당 손실로 이어질 수있는 칼럼의 건조로서, understated 수 없습니다.) 건조를 실행하도록 허용하지 마십시오. 세차 단계 2 (드로서 Collagenase + DNase를 포함하는 분리 버퍼 믹스로 열을 헹굼단계 1.7)에 scribed,이 죽었거나 죽어가는 종양 세포에서 끈적끈적한 부스러기를 제거하기 위해 "엄격한"세차 단계로서의 역할을합니다. 맥에서 버퍼와 3 단계를 씻어 수행;을 통해 흐름 세척 3 단계 이후에 완전히 명확 보이지 않는 경우, 맥 버퍼 (5 세차장의 총) 2 추가 세척 단계를위한 세차로 진행합니다. 대형 피하 종양의 경우 (예 : B16 흑색증), 마지막 세탁 단계 동안, 열의 가기 장갑 낀 손가락으로 부드럽게 압력을 적용,이 세포 인구를 정화, 청소기를 위해 여분의 파편을 출시. 이 단계 등 전립선과 같은 견고한 조직 종양 필요하지 않습니다, 대신, 적어도 5-6 총 회 세척, 세차 추가 단계를 사용하십시오. 마그네틱 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 회수 관에 배치하십시오. 열 고정 버퍼의 피펫이 ML. 단단히 칼럼과 함께 제공된 플런저를 적용하여 자기 (磁 气)라고 표시된 세포를 수집합니다. 하여 세포 수를 계산하고 선택한 셀 인구를 위해 순결을 확인cytometric 분석을 흘러. 직류 인구의 식별 들어, 제안된 마커는 B220와 CD11b CD45, CD11c, PDCA-1을 포함합니다. 제안 대식 세포 마커는 CD45, CD11b, F4-80, 그리고 Ly6C를 포함합니다. 2. 피하 B16 흑색증 종양에서 Adoptively 전송되는 T 세포의 분리 이 프로토콜은 250mm 2 또는 (종양 bisecting 직경을 측정하여 추정) 적은 종양 함께 잘 작동됩니다. B16 종양 세포는 C57BL으로 subcutaneously 주입되었다 / 6 마우스 및 종양 성능은 매 2 일간 8을 기록했다. 250mm 2를 측정하는 악성 종양으로 마우스는 CO 2 질식에 의해 euthanized있다. 70% ETOH로 씻어서 autoclaved 수술 도구를 사용하여 작은 (<3mm) 조각으로 종양을 잘라 5 ML 분해 용액 (RPMI 배지 5 % FBS, Collagenase 유형 나 (200 U / ML)와 DNase I (100 μg으로 보충에 품어 37 30 분 ° C, 용 / ML)가) (1,000 μ를 사용 Pipetting난 pipet 팁) 및 부화 도중에 10 분마다 vortexing. 골수양 세포가 연속적으로 고립되는 경우 FBS 및 Collagenase 10 % FBS 각각 Collagenase 유형 IV (200 U / ML)로 나를 입력 5 %를 대체. 부화 후 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과하고 10 ML 맥에서 버퍼 (제조 업체의 지침, Miltenyi 생명 공학 당 준비)로 두 번 씻는다. 선택 사항 – 매우 큰 종양을 위해 (> 300mm 2), 염증 세포 밀도 기울기 원심 분리를 (Percoll 또는 Ficoll)를 사용하여 미리 풍부하게 할 수 있습니다. 세차 뜨는을 대기음 1 μg anti-CD16/32 antibody/10 8 세포 (클론 2.4.G2 문화 뜨는 200 μl) 추가하고 10 분 동안 상온에서 품어. 세탁없이 부드럽게 빛을 차단할 얼음에서 30 분 동안 관과 부화를 flicking하여 잘 섞어, 10 8 셀 당 1 μg 안티 Thy1.1 PE 항체를 추가합니다. 언바운드 PRI를 제거하는 세포를 씻으15 분 400 XG 10 ML 맥을 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 메리 항체. 뜨는을 대기음 및 제조 지침에 의하면, 10 7 전체 세포 당 20 μl 방지 PE microbeads를 (Miltenyi 생명 공학) 추가합니다. 부드럽게 튜브 (와동하지 않음) flicking에 의해 잘 섞어서 4에 품어 ° C에서 빛으로부터 차폐된 15 분 동안 (얼음을 사용하지 마십시오). 주의 : vortexing은 구슬의 무결성을 축소하실 수 있습니다. 15 분 400 XG에 맥을 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 500 μl 맥에서 버퍼에 뜨는, 그리고 resuspend 세포를 기음. 큰 크기 (> 300mm 2) 종양의 경우, 1 ML 버퍼를 사용합니다. 자기장 분리기에 놓으 LC (대형 셀) 칼럼. 종양 세포 현탁액이 컬럼을 통해 최선을 흘러. 열을 프라임 500 μl 맥에서 버퍼로 컬럼을 씻어. 대부분의 종양은 또한 LS와 LD 열 (Column)을 통해 흐름,하지만 더 소화 및 기계적 d를 요구합니다단일 세포 현탁액의 적정 수준을 달성하기 isruption. 컬럼을 수상하는 데 1 ML 맥을 버퍼로 컬럼을 씻으십시오. 칼럼에 세포 현탁액을 적용하고 (열 실행 건조시키는없이) 완전히 통해 흐를 수 있습니다. 다음, 500 μl 맥 버퍼로 씻고, 그리고 배 세척 반복한다. 만 열 저수지가 비어있을 때 새로운 버퍼를 추가할 수 있지만 열에 흐름없이 서있하지 않습니다. 이것은 막힘 및 줄었 순결을 초래하게됩니다. 이것은 대형 피하 종양을위한 중요한 단계입니다 : 마지막 세척 단계 후, 장갑 낀 손가락 팁 함께 자성 분리기에 한동안 여전히 열 상단에 부드러운 압력을 적용합니다. 이것은 순전히 더 풍부한 인구를위한 여분의 파편을 출시. 다음, 500 μl 맥 버퍼로 열에 한 번 더 씻는다. 구분에서 컬럼을 제거하고 깨끗한 15 ML 원뿔 튜브에 넣고, 열을에 두 ML 맥을 버퍼를 추가합니다. 자기 (磁 气) – 라벨 cel을 플러시단단히 열에 플런저를 밀어인가요. 5 분 400 XG에 eluted 소수를 원심 분리기. 이 단계에서 순도는 일반적으로 75-80% 사이입니다. > 90 % 순도를 달성하려면, 같은 새 MS 컬럼을 사용하여 단계 1.10-1.12에서 설명한 자기 분리 절차를 반복하십시오. MS 열에는 현탁액이 칼럼을 통해 더 느리게 실행됩니다 있도록 더 작고 컴팩트하지만, 높은 숫자와 관심 세포의 순도를 얻을 것입니다. 추가 실험을 위해 휴대폰 번호를 백작과 흐름 cytometric 분석에 의해 순도를 확인합니다. 이와 프로토콜에 설명된 것과 adoptively 양도 T 세포의 격리 내용 확인을위한 allelic 마커는 CD45과 Thy1.1 (양도 세포)와 Thy1.2 (호스트 T 세포)를 포함합니다. 3. 대표 결과 특정 세포 인구 (즉, macrophages, DC, T 세포 등)의 생산량은 종양의 크기와 관리자했다 트리 트먼트에 따라 달라집니다종양이 성장하는 동안 istered. 치료 14~16주 옛 계집 마우스의 전립선은 5-1×10 6 CD11c + / PDCA-1 90~95% 순도 또는 1×10 6-1.5×10 6 F4/80에서 + (DC) 세포 + / CD11b 8×10과 사이에 양보해야 + (macrophages) 티슈 300 MG 80-90% 순도의은 그림 1에 나타난 위의 절연 절차를 따르는. 이들 세포의 각각의 숫자가 약간 종양 – 항원 특정 T 세포의 입양 전송에 따라 증가합니다. 나쁨 순도는 (열에 종양 부스러기 보존이 발생할 수 있음) 열에 건조 있도록, 보통 불충 분한 세척의 결과이다, 또는 부족 FC 수용체가 차단. 마찬가지로, B16 종양으로부터 격리 총 세포는 또한 조직의 수확 시간 및 DC 백신 여부에 상관없이 T 세포 (5×10 6 환승) (1×10 5 송금)의 입양 전송에서 종양의 크기에 따라 달라집니다. 아주 몇 가지 항원-spe항원 펄스 직류 백신도 T 세포 전송 후 하루 주어진 경우를 제외하고 cific T 세포는 종양에 침투. DC 백신은 작고, 만져서 알 수있는 (<50mm 2) 종양을 간직한 마우스, 80~85%의 순도로 약 3×10 5 Thy1.1 + T 세포의 수율로 관리되는 경우, "좋은 간주됩니다 "같은 그림 2A에 표시된 수확. 큰 종양이 수확되는 경우에는 총 수율과 순도가 감소됩니다. Macrophages (F4/80 + / CD11b +) 보통 B16 종양의 전체 세포의 작은 비율입니다. 그림 2B는 종양에서 CD11b를 활용하는가 250mm이 있는지 보여줍니다 90~95% 순도로 약 1×10 6 macrophages를 얻을 . B16 종양의 직류 인구가 이질적인 것을 또한 그림 2B 프로그램. 전립선 종양, 두 subpopulations 달리 : CD11c + / PDCA-1 + (plasmacytoid DC)와 CD11c+ / PDCA-1 – (종래의 직류)은 B16 흑색증 종양에서 얻을 수있다. 예상 2×10 6 PDC와 4×10 6 CDC는 80~90% 순도에서 250mm 2 B16 종양으로 예상된다. 절감 순도는 일반적으로 기둥에서 종양 세포를 청소하지 않은 결과입니다. 단계 2.12이 칼럼의 기지에서 지속 흑색증 세포의 작은 덩어리를 제거하는 중요한 단계입니다. 이 단계를 따르면 더 순도의 세척 단계와 결과의 효율성을 향상시킵니다. 그림 1. DC가 (CD11c + / PDCA-1 +) 및 macrophages (F4/80 + / CD11b +)은 도라 무통 전립선 종양으로부터 격리되었다. 도트 줄거리 값은 관심을 사전 또는 사후 정화의 세포의 비율을 나타냅니다. 그림 2. () Adoptiv일리는 Thy1.1 + / CD8 + T 세포를 전송하고 (B) CD11c + / PDCA-1을 포함한 골수양 세포 + plasmacytoid DC가, CD11c + / PDCA-1 – 기존의 DCS 및 F4/80 + / CD11b + macrophages는 피하로부터 고립되었다 Thy1.2 + 마우스에서 B16 흑색증 종양. 도트 줄거리 값은 관심을 사전 또는 사후 정화의 세포의 비율을 나타냅니다.