Summary

Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Vi beskriver en metode for generering av regulatoriske, minne og naive T-celler fra et enkelt menneske blodgiver. Polarisert Tregs kan deretter sammenlignes med andre undergrupper i en rekke genetiske og funksjonelle applikasjoner med genetisk homogenitet, inkludert en undertrykkelse analysen også beskrevet her.

Abstract

Utvikling og vedlikehold av immunsuppressive CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) bidra til perifer toleranse for å forbli i immunologisk homeostase med den enorme mengden av selvtillit og Commensal antigener i og på menneskekroppen. Forstyrrelsene i balansen mellom Tregs og inflammatoriske konvensjonelle T-celler kan resultere i immunopathology eller kreft. Selv om terapeutisk injeksjon av Tregs har vist seg å være effektiv i murine modeller av pt kolitt, type I 2 diabetes, revmatoid artritt og graft versus host sykdom, 4 flere grunnleggende forskjeller i menneskelige versus mus Treg biologi 5 har hittil utelukket klinisk bruk. Mangelen på tilstrekkelig antall, renhet, stabilitet og homing spesifisitet av terapeutisk Tregs nødvendiggjorde en dynamisk plattform for menneskelig Treg utvikling som å optimalisere forholdene for sin ex vivo ekspansjon 6.

Her har vi describe en metode for differensiering av indusert Tregs (iTregs) fra et enkelt menneske perifert blod donor som kan brytes ned i fire stadier: isolasjon av perifere mononukleære blodceller, magnetisk utvalg av CD4 + T celler, in vitro cellekultur og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) av T-celle undergrupper. Siden Treg signaturen transkripsjonsfaktor forkhead boksen P3 (FoxP3) er en aktivering-indusert transkripsjonsfaktor i mennesker 7 og ingen andre unike markør eksisterer en kombinatorisk panel av markører må brukes til å identifisere T-celler med suppressor aktivitet. Etter seks dager i kultur, kan celler i systemet vårt skal avgrenses til naive T-celler, minne T-celler eller iTregs basert på deres relative uttrykk for CD25 og CD45RA. Som minne og naive T-celler har forskjellige rapporterte polarisering krav og plasticities 8, pre-sortering av den første T-celle befolkningen inn CD45RA + og CD45RO + undergrupper kan be brukes til å undersøke disse avvikene. Konsistent med andre, vår CD25 Hi CD45RA iTregs uttrykte høye nivåer av FoxP3 9, GITR og CTLA-4 11 og lave nivåer av CD127 12. Etter FACS av hver populasjon, kan resulterende celler brukes i en Lyddemper analysen som evaluerer den relative evnen til å forsinke spredning av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-merket autolog T-celler.

Protocol

1. Isolering av humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) fra Buffy Coat Erverve en enhet av Buffy Coat fra sykehuset eller i nærheten blod sentrum. Vårt blod senter gir oss om 40-60 ml av Buffy Coat per enhet hentet fra normale blodgivere. Hell blod inn i en autoklaveres 500 ml glass flaske inneholder sterilt PBS å fortynne Buffy Coat. Den endelige volumet av PBS + Buffy Coat bør være 250 ml. Fyll ti 50 ml koniske rør hver med 20 ml Lymphoprep løsning. Forsiktig ov…

Discussion

Mens Treg overføring holder enorm terapeutisk løftet i kampen mot autoimmunitet pode avvisning og andre immun eller provoserende-mediert lidelser, metoder for deres effektiv produksjon og stabil vedlikehold ennå ikke er utviklet. Som bare 1-5% av sirkulerende menneskelige T-celler er Tregs, overvinner deres kontrollert ekspansjon og differensiering dette sparsomt som en stor avskrekkende for gjennomføringen av Tregs inn i klinikken. På den annen side, så vi lært fra TGN1412 rettssaken 13, er det vitens…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Forfatterne ønsker å takke Jennifer Strange og Greg Bauman for deres assistanse med flowcytometrisystemer analyse og sortering. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant Number 2P20 RR020171 fra NCRR og ved University of Kentucky oppstart midler til FM, GIE erkjenner støtte av Presidential Graduate Fellowship og Kentucky Opportunity Fellowship.</p>

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

Referências

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
  2. Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
  3. Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
  4. Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
  5. Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
  6. Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
  7. Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
  8. Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
  9. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
  10. McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
  11. Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
  12. Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
  13. Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
  14. Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).

Play Video

Citar este artigo
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

View Video