Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória
Summary
Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.
Abstract
O desenvolvimento e manutenção das células T CD4 + de imunossupressores células T reguladoras (Tregs) contribuem para a tolerância periférica necessária para permanecer na homeostase imunológica com a grande quantidade de antigénios próprios e comensais e no corpo humano. Perturbações no equilíbrio entre Tregs e inflamatórias células T convencionais podem resultar em imunopatologia ou cancro. Embora a injecção terapêutica de Tregs foi mostrado para ser eficaz em modelos murinos de colite 1, diabetes tipo I 2, artrite reumatóide e doença do enxerto versus hospedeiro, 4 várias diferenças fundamentais em humanos versus rato Treg biologia 5 tem, até agora impedida a utilização clínica. A falta de um número suficiente, pureza, estabilidade e especificidade de homing terapêutico Tregs exigiu uma plataforma dinâmica do desenvolvimento Treg humana em que para optimizar as condições para a sua expansão ex vivo 6.
Aqui nós Dcircunscrever um método para a diferenciação de induzida Tregs (iTregs) a partir de um único dador de sangue periférico humano, que pode ser dividido em quatro etapas: isolamento de células mononucleares do sangue periférico, a selecção magnética de células T CD4 +, em cultura celular in vitro e fluorescência activado separação de células (FACS) de subconjuntos de células T. Uma vez que o factor de transcrição Treg assinatura P3 caixa forkhead (FoxP3) é um factor de transcrição induzida por activação em seres humanos 7 e sem outros marcadores únicos existe, um painel de combinatória de marcadores, deve ser utilizado para identificar as células T com actividade supressora. Depois de seis dias em cultura, as células no nosso sistema pode ser demarcada em naive células T, células T de memória ou iTregs com base na sua expressão relativa de CD25 e CD45RA. Como as células T de memória e naïve têm diferentes requisitos de polarização relatados e plasticidades 8, pré-triagem da população inicial de células T em CD45RA + e CD45RO + subconjuntos pode be usado para examinar essas discrepâncias. Consistente com os outros, nossa CD25 Hi CD45RA – níveis elevados de iTregs expressas FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e baixos níveis de CD127 12. Na sequência de FACS de cada população, as células resultantes podem ser utilizados num ensaio de supressor que avalia a capacidade relativa para retardar a proliferação de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-rotulado células T autólogas.
Protocol
Discussion
Enquanto a transferência Treg promissora terapêutico no combate enorme rejeição do enxerto autoimunidade e outras desordens imunitárias ou inflamatórias mediadas, métodos para a sua geração eficiente e manutenção estável ainda não tenham sido desenvolvidos. Como apenas 1-5% de circulação de células T humanas são Tregs, a sua expansão controlada e diferenciação supera esta escassez como um impedimento principal da aplicação de Tregs na clínica. Por outro lado, como aprendemos com o julgamento TGN14…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
Referências
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
