Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.
Abstract
Die Entwicklung und Pflege von immunsuppressiven CD4 + regulatorischen T-Zellen (Tregs) Mitwirkung an der peripheren Toleranz notwendig, um in immunologischen Homöostase mit der großen Menge von sich selbst und kommensalen Antigene in und auf den menschlichen Körper verbleiben. Störungen in der Balance zwischen Treg und entzündlichen konventionellen T-Zellen können in Immunpathologie oder Krebs führen. Obwohl therapeutische Injektion von Tregs gezeigt wurde, dass sein in Mausmodellen der Colitis 1, Diabetes Typ I 2, rheumatoider Arthritis und graft versus host disease, 4 einige grundlegende Unterschiede in der menschlichen Biologie im Vergleich zu Maus Treg 5 wirksam ist bislang klinischen Einsatz ausgeschlossen. Das Fehlen einer ausreichenden Zahl, Reinheit, Stabilität und Spezifität der therapeutischen Homing Tregs erforderte eine dynamische Plattform des menschlichen Treg Entwicklung, auf denen Voraussetzungen für ihre ex vivo Expansion von 6 bis zu optimieren.
Hier we describe ein Verfahren zur Differenzierung von induzierten Tregs (iTregs) aus einem einzigen menschlichen peripheren Blut-Donor, bei dem in vier Stufen unterteilt werden: Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen, magnetische Selektion von CD4 + T-Zellen in vitro Zellkultur und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) von T-Zell-Untergruppen. Da die Treg Unterschrift Transkriptionsfaktors forkhead box P3 (FOXP3) ist ein Aktivierungs-induzierten Transkriptionsfaktor beim Menschen 7 und keine andere einzigartige Marker vorhanden ist, eine kombinatorische Panel von Markern muss verwendet werden, um T-Zellen mit Suppressor-Aktivität zu identifizieren. Nach sechs Tagen in Kultur, kann Zellen in unserem System in naive T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen oder iTregs ihrer relativen Expression von CD25 und CD45RA Basis abgegrenzt werden. Als Erinnerung und naiven T-Zellen unterschiedlicher Polarisation berichtet Anforderungen und Plastizitäten 8 haben, Vorsortierung des ursprünglichen T-Zell-Population in CD45RA + und CD45RO + Teilmengen können be verwendet, um diese Unstimmigkeiten zu prüfen. In Übereinstimmung mit anderen, unsere CD25 Hallo CD45RA – iTregs Express ein hohes Maß an FoxP3 9, GITR und CTLA-4-11 und geringe Mengen an CD127 12. Nach FACS jeder Population, kann resultierenden Zellen in einer Suppressor-Assay, der die relativen Fähigkeit, die Proliferation von Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE)-markierten autologen T-Zellen verzögert bewertet werden.
Protocol
Discussion
Während Treg Transfer birgt ein enormes therapeutisches Versprechen im Kampf gegen Autoimmunität Transplantatabstoßung und anderen Immunerkrankungen oder entzündlichen vermittelten Erkrankungen, Methoden für ihre effiziente Erzeugung und Aufrechterhaltung stabiler sind noch nicht entwickelt worden. Da nur 1-5% der zirkulierenden humanen T-Zellen Tregs sind, überwindet ihre kontrollierte Expansion und Differenzierung dieser Mangel als eine große Abschreckung der Umsetzung der Tregs in die Klinik. Auf der anderen S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
Referências
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