Förutsägelsen av coreceptor användning av HIV-1 krävs för administrationen av en ny klass av antiretrovirala läkemedel, dvs coreceptor antagonister. Det kan utföras genom sekvensanalys av<em> Env</em> Gen och efterföljande tolkning genom ett internetbaserat tolkning system (geno2pheno<sub> [Coreceptor]</sub>).
Maravirok (MVC) är den första licensierade antiretrovirala läkemedel från klassen coreceptor antagonister. Det binder till värden coreceptor CCR5, som används av de flesta HIV-stammar för att infektera de humana immunceller (Fig. 1). Andra HIV-isolat använder en annan coreceptor, CXCR4. Vilken receptor används, bestäms i viruset av Env-protein (fig. 2). Beroende på den använda coreceptor, är virusen klassas som R5 eller X4, respektive. MVC binder till CCR5-receptorn inhiberar inträdet av R5 virus i målcellen. Under sjukdomen kan X4 virus uppstår och växa R5 virus. Fastställande av coreceptor användning (även kallad tropism) är därför obligatoriskt före administrering av MVC, som begärts av EMA och FDA.
Studierna för MVC effektivitet motivera, meriter och 1029 har utförts med Trofile analysen från Monogram, San Francisco, USA Det här är en högkvalitativ analys baserad på Sophisticated rekombinanta tester. Acceptansen för detta test för daglig rutin är ganska låg utanför USA, eftersom de europeiska läkarna snarare tenderar att arbeta med decentraliserade expertlaboratorier, som också ger samtidig resistenstestning. Dessa laboratorier har genomgått flera utvärderingar kvalitetssäkring, det sista en som presenteras i 2011 1.
Under flera år har vi utfört tropism bestämningar baserade på sekvensanalys från HIV-env-V3-gen-regionen (V3) 2. Denna region bär tillräckligt med information för att göra en tillförlitlig prognos. Den genotypisk bestämning av coreceptor användning ger fördelar såsom: kortare omsättningstid (motsvarande resistensbestämning), lägre kostnader, möjlighet att anpassa resultaten till patienternas behov och möjlighet att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL ), särskilt eftersom antalet prover som analyseras med VL <1000 kopior / ilgrovt ökat under de senaste åren (fig. 3).
De viktigaste stegen för tropism test (Fig. 4) visade i denna video:
1. Uppsamling av ett blodprov
2. Isolering av HIV-RNA från plasma och / eller HIV-proviralt DNA från mononukleära blodceller
3. Amplifiering av env-regionen
4. Amplifiering av V3-regionen
5. Sekvens reaktion av V3 amplikon
6. Rening av sekvenseringen proverna
7. Sekvensering de renade proverna
8. Sekvens redigering
9. Sekvensering tolkning av data och tropism förutsägelse
V3-sekvensen medger en tillförlitlig virala tropismen förutsägelse, som visas i kliniska studier 3-9. I själva verket är genotypiska beslutsamhet övervägs i de nuvarande europeiska och tysk-österrikiska riktlinjerna 10.
Jämfört med fenotypiska tester, inte bara är omsättningen kortare (ekvivalent med resistensbestämning), utan även är kostnaderna. Dessutom är en stor fördel med genotypiska tester att resultaten klassificeras som FPR och kan därför anpassas till patienternas behov. Trofile resultat, å andra sidan, är helt enkelt R5 eller X4 rapporter och tillgång till rådata anges inte.
För närvarande är de europeiska riktlinjerna föreslår en FPR cut-off 20% 10, medan de österrikisk-tyska riktlinjerna tillåter anpassa FPR cut-off specifikt till varje patients behov 11. I denna linje, för patienter med ett brett utbud av antiretrovirala läkemedel alternativ, högre FPR cut-off (> 20%) är rekommavslutades. Omvänt, för kraftigt förbehandlade patienter med begränsade behandlingsalternativ, lägre FPR cut-off (> 5%) kan användas. Denna typ av terapi vägledning pågår med resistensbestämning till NRTI, NNRTI, PI och Inis, där delvis aktiva läkemedel kan ingå i behandlingen av patienter med nedsatt terapeutiska alternativ. Dessutom, med allt fler genotypiskt-styrda terapi förändringar, kliniskt relevant FPR cut-offs ständigt justeras med en panel av bioinformatiker, virologer och kliniker.
En annan viktig fördel med genotypiska tropism testning är möjligheten att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL). I detta fall, när plasma-RNA inte amplifierbara, kan det provirala DNA sekvenseras och användas för tillförlitliga förutsägelser 9,12. Att notera, har antalet patienter med låg eller ej detekterbar virusmängd ökat kraftigt under de senaste åren. Hittills, Trofile analysen tillåter endast analys av prover från patienter med VL <1000 kopior / ml. Emellertid har preliminära studier visat att proviralt DNA kan också adecuate att testas med Trofile 13.
The authors have nothing to disclose.
Författarna finansieras från Corus, MedSys cellinmatning, kedja och Resina projekt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Diagnostics | 04 802 993 001 | |
MagNA Pure Compact System | Roche Diagnostics | 03731146001 | |
T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |