Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

프로토콜은 그림에 요약되어 있습니다. 4. 1. 혈액 샘플 수집 임상 사이트에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 튜브의 최소 3 ML의 피를 수집합니다. 샘플은 4 ° C.에서 주일까지 저장 될 수있다 일반 우편으로 즉시 실험실로 가능한 한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 혈액 샘플을 보낼 수 있습니다. 2. HIV RNA 및 / 또는 DNA의 분리 마그나 순수 컴팩트 핵산 절연 I 키트 I와 마그나 순수 컴팩트 시스템을 사용하여, 1000 μl 전체 혈액, 혈청 또는 혈장에서 바이러스 성 RNA 및 / 또는 DNA를 구합니다. 50 μl TE 버퍼에 얻은 RNA 나 DNA를 Elute. 또한, 다른 핵산 정화 절차를 사용할 수 있습니다. 3. 유럽​​ 표준안 지역의 증폭 플라즈마 RNA 또는 DNA proviral 하나의 유럽 표준안 지역 (도 2 및 4) 증폭. 환경을 단백질의 대부분을 포함하는 1245 BP-긴 제품 (NT 6556-7811 accordinHXB2에 대한 g)가 생성됩니다. RNA 샘플 : RT-PCR 반응 바이러스 성 RNA는 RT 반응을 방해 할 수 있습니다 매우 복잡한 이차 구조 (그림 4) 제공합니다. 이 문제를 방지하려면 10 분 (이미 PCR 튜브 및 PCR 기계에서)에 대해 65 ° C에서 10 μl RNA를 배양 한 후 50 ° C.에 온도를 감소 프리 머 환경을-F와 환경을-R을 포함하여 PCR 마스터 믹스의 40 μl를 추가합니다. 하우스 – 시스템에서 RT-PCR을위한 마스터 믹스 : 볼륨 / 반응 (μl) 최종 농도 RNase 무료 H 2 O 14.4 5 배 버퍼 (Qiagen OneStep RT-PCR 키트) 10 1X 5 배 Q-솔루션 10 1X dNTP 믹스 (10 MM 각) <td> 2 각 dNTP 400 μM Enzym – 믹스 (Qiagen OneStep RT-PCR 키트) 이 프라이머 환경을-F (100 μM) 0.3 0.6 μM 프라이머 환경을-R (100 μM) 0.3 0.6 μM RNase 억제제 (RNasin) 1 5 단위 / 반응 환경을-F : 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA의 -3 '(NT 6,556 → 6,586 HXB2에 따라) 환경을-R : 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7,811 NT 7785) 30 분 50 ° C에서 RT 반응을 실행합니다. 다음과 같이 첫 번째 PCR을 실행합니다 : 95 ° C, 15 분 1 개 95 ° C, 30 초 50 ° C, 30 초 72 ° C, 2 분 </td> 1 개 95 ° C, 30 초 56 ° C, 30 초 72 ° C, 2 분 38 X 72 ° C, 10 분 4 ° C ∞ DNA 샘플 : PCR 반응 proviral DNA 샘플를 들어, 초기 RT 반응이 필요하지 않습니다, 그리고 PCR 반응에 직접 시작할 수 있습니다. provial DNA의 10 μl로 PCR 마스터 믹스의 40 μl를 추가합니다. 하우스 – 시스템에서 PCR을위한 마스터 믹스 : 볼륨 / 반응 (μl) 최종 농도 RNase 무료 H 2 O 15.4 5 배 버퍼 (HotStarTaq의 DNA 중합 효소) 10 1X 5 배 Q-솔루션 10 1X dNTP 믹스 (10 MM 각) 이 각 dNTP 400 μM Enzym – 믹스 (HotStarTaq의 DNA 중합 효소) 이 프라이머 환경을-F (100 μM) 0.3 0.6 μM 프라이머 환경을-R (100 μM) 0.3 0.6 μM 환경을-F : 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA의 -3 '(→ 6,586 NT 6556) 환경을-R : 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7,811 NT 7785) 이전 RNA 샘플 (단계 3.1.4)에 대한 설명으로 PCR 조건을 실행합니다. 4. V3 지역의 증폭 : 중첩 된 PCR 중첩 된 PCR를 들어, 템플릿으로 첫 번째 PCR 반응 (아가로 오스 겔에서 이전 분석없이)에서 5 μl를 사용하여 PCR 매스의 95 μl를 추가합니다적이 섞는다. 중첩 – 인 – 하우스 PCR을위한 마스터 믹스 볼륨 / 반응 (μl) 최종 농도 H 2 O 61.9 10X PCR 버퍼 10 1X 5 배 Q-솔루션 20 1X dNTP 믹스 (10 MM 각) 이 각 dNTP 200 μM 프라이머 환경을-2F (100 μM) 0.3 0.6 μM 프라이머 환경을-2R (100 μM) 0.3 0.6 μM HotStarTaq의 DNA 중합 효소 0.5 2,5 단위 / 반응 환경을 – 2 층 : 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(NT 6,838 → 6,864) <strong> 환경을-2R : 5'-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3 '(← 7,742 NT 7712) 다음과 같이 PCR을 실행합니다 : 93 ° C, 15 분 1 개 95 ° C, 30 초 50 ° C, 30 초 72 ° C, 90 초 1 개 95 ° C, 30 초 56 ° C, 30 초 72 ° C, 90 초 43 X 72 ° C, 10 분 4 ° C ∞ 1 % 아가로 오스 겔 (그림 4)에서 PCR 제품을 분석합니다. 예상 제품은 902 BP-깁니다. 시퀀싱 샘플 정화. 공급 업체가 제공하는 프로토콜 솔루션 및 마이크로 열을 사용하여 Qiagen PCR-정화 키트 PCR 제품을 정화. 밴드 강도에 따라 30-100 μl PE 버퍼에 Elute. 또는 샘플이 Exonuclease를 사용하여 정화 할 수 있습니다I 빠른 AP (열 알칼리성 인산 가수 분해 효소). 이러한 목적을 위해, 15 μl PCR 제품에 6 μl 엑소-AP 믹스를 추가하고 37 15 분 품다 ° C. 580 μl H 2 O 66 μl 빠른 AP 13.4 μl 엑소 I 5. V3의 amplicon의 순서 반응 순서 반응은 다음과 프리 머 중 하나를 사용하여 PCR 반응으로 구성되어 있습니다 : 환경을-2 : 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (→ 6,980 NT 6959) 환경을-5 : 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA – 3 '(← 7,371 NT 7352) 환경을-6 : 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC – 3 '(→ 7,000 NT 6979) 환경을-7 : 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC – 3 '(← 7,549 NT 7530) 환경을-10 : 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC – 3'(← 7,507 NT 7478) 환경을-11 : 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC – 3'(← 7,664 NT 7638) 첫 번째 선택 프리 머은 다음과 같습니다 환경을-2, 환경을-6 또는 환경을-7, 환경을-11 템플릿으로 정화 V3의 amplicon에서 1 μl를 사용하여 PCR 마스터 믹스 9 μl를 추가합니다. 마스터 믹스를 순서 : 4 μl 순서 믹스 (HIV-Genotyping 키트) 4 μl H 2 O 1 μl 입문서 (100 pmol / μl) 다음과 같은 순서 반응을 실행합니다 : 96 ° C, 10 초 50 ° C, 10 초 36 X 60 ° C, 45 초 4 ° C ∞ 6. 시퀀싱 샘플 정화 시퀀스 usi 정화NG Sephadex G-50 극상의. Sephadex G-50 극상의와 '열 로더 "에 우물의 적절한 수를 입력합니다. 이상 설정하여 필터 판 MAHVN4510에 Sephadex를 전송합니다. 필터 플레이트의 각도에 300 μl 밀리 Q H 2 O를 추가하고 2-8에서 최소한 3h을 위해 길러 ° C. 910Xg 및 4-15 ° C.에서 5 분의 번호판을 원심 분리기 흐름을 통해 폐기하십시오. 순서 제품 및 다음 악단 Sephadex 판에 pipet 순서에 10 μl H 2 O를 추가합니다. 정화 제품을 얻으려면 5 분의 판을 원심 분리기. 910Xg 및 4-15에서 ° C와 흐름을 통해 수집합니다. 7. 시퀀서 ABI 프리즘 3130 XL에 정화 샘플을 시퀀스 각 실행하기 전에 버퍼를 변경 폴리머 (POP7)의 볼륨을 확인합니다. 필요한 경우, 새로운 하나 기존의 폴리머 플라스크를 교체하십시오. 18초의 주입 시간을 포함하여 저장된 실행 조건을 사용. 이 기계에서, 16​​ 순서 샘플과 하나가 실행의 신호 데이터의 수집은 약 60 분 (36cm 모세관) 또는 150 분 (50cm 모세관)이 소요됩니다. 8. 순서 편집 시퀀스 (그림 5) 정렬 및 편집하는 프로그램 Lasergene (DNA-스타)를 사용합니다. 다른 시퀀스 편집 프로그램을 사용할 수 있습니다. "V3 – 연합의 B"와 참조로 환경을 합의 순서를 사용합니다. Lasergene이 가능하며, FASTA 파일로 저장 모든 원시 데이터를 사용하여 분석 샘플의 합의 순서를 만듭니다. FASTA 파일은 샘플의 이름과 염기 순서와 헤더를 포함하는 텍스트 파일입니다. 9. 데이터 해석 및 tropism 예측을 시퀀싱 데이터 해석을 시퀀싱하는 것은 웹 기반 통역 시스템에 의해 수행되는 geno2pheno [coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). tropism 예측의 경우, 다른 FPR 설정을 선택할 수 있습니다. 기본 설정은 독일 – 오스트리아 치료 가이드 라인에 따라 수 있습니다. FPR ≥ 20 %, 바이러스는 R5로 분류 할 때 FPR ≥ 20 %, FPR <12.5 %에 X4. 서버에 FASTA 파일을 업로드합니다. 이 서버는, 아미노산으로 염기 순서를 변환 V3 – 연합의 B 순서로 정렬하고 하위 유형 분류를 생산하고 있습니다. 또한, 거짓 긍정적 인 속도 (FPR)으로 표현 (그림 4) coreceptor 사용량 예측을 생성합니다. 10. 대표 결과 geno2pheno [coreceptor] 출력 tropism의 등급 해석을 보여줍니다. coreceptor 사용 가능성에 따라, 통역 텍스트와 배경 색상이 가능한, 낮은 위험을 제안하고 마지막으로 빨간색으로, 노란색으로, MVC에 대한 안전 관리를 제안, 녹색 (<20 있습니다.