De voorspelling van de coreceptor gebruik van HIV-1 is vereist voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen, namelijk coreceptor antagonisten. Het kan worden uitgevoerd door sequentieanalyse van de<em> Env</em> Gen en de daaropvolgende interpretatie door middel van een op internet gebaseerde interpretatie systeem (geno2pheno<sub> [Coreceptor]</sub>).
Maraviroc (MVC) is de eerste goedgekeurde antiretrovirale geneesmiddel van de klasse van co-receptor antagonisten. Het bindt aan de coreceptor CCR5 gastheer die wordt gebruikt door de meeste HIV-stammen om de menselijke immune cellen (Fig. 1) infecteren. Andere HIV-isolaten een andere coreceptor, de CXCR4. Die receptor wordt gebruikt, wordt bepaald door het virus Env-eiwit (Fig. 2). Afhankelijk van de coreceptor, worden de virussen geclassificeerd als R5 of X4 respectievelijk. MVC bindt aan de CCR5 receptor remmen van de opneming van R5 virussen in de doelcel. In de loop van de ziekte, kan X4 virussen ontstaan en groeien de R5 virussen. Bepaling van coreceptor gebruik (ook wel tropisme) is daarom absoluut noodzakelijk voor toediening van MVC, waarop door EMA en FDA.
De studies voor MVC efficiëntie te motiveren, MERIT en 1029 zijn uitgevoerd met de Trofile bepaling van het Monogram, San Francisco, Verenigde Staten Dit is een hoge kwaliteit assay gebaseerd op Sophisticated recombinant tests. De aanvaarding van deze test voor de dagelijkse routine is vrij laag buiten de Verenigde Staten, omdat de Europese artsen eerder de neiging om te werken met decentrale deskundige laboratoria, die ook voorzien gelijktijdige weerstand testen. Deze laboratoria hebben ondergaan verschillende kwaliteitsborging evaluaties, de laatste wordt gepresenteerd in 2011 1.
Sinds enkele jaren, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd tropisme vaststellingen op basis van sequentie-analyse van de HIV env-V3-gen regio (V3) 2. Deze regio draagt voldoende informatie om een betrouwbare voorspelling te voeren. De genotypische bepaling van coreceptor gebruik biedt voordelen zoals: kortere doorlooptijd (gelijk aan het testen van resistentie), lagere kosten, de mogelijkheid om de resultaten aan te passen aan de behoeften van de patiënt en de mogelijkheid van het analyseren van klinische monsters met een zeer lage of zelfs niet-detecteerbare viral load (VL ), met name omdat het aantal monsters geanalyseerd met VL <1000 kopieën / ulruwweg toegenomen in de laatste jaren (Fig. 3).
De voornaamste stappen voor tropisme testen (Fig. 4) toonde in deze video:
1. Verzamelen van een bloedmonster
2. Isolatie van het HIV RNA uit het plasma en / of HIV proviraal DNA van mononucleaire bloedcellen
3. Amplificatie van het env-gebied
4. Amplificatie van het V3 gebied
5. Sequentie reactie van de V3 amplicon
6. Zuivering van de sequentie samples
7. Sequencen van het gezuiverde monsters
8. Sequence bewerken
9. Sequencing data-interpretatie en tropisme voorspelling
De V3-sequentie maakt een betrouwbare voorspelling virale tropisme, zoals getoond in klinische studies 3-9. In feite is genotypische bepaling overwogen in de huidige Europese en Duitse-Oostenrijkse richtlijnen 10.
Vergeleken met fenotypische testen niet alleen de omzet korter (gelijk aan resistentietest), maar ook zijn de kosten. Daarnaast is een groot voordeel van genotypische testen is dat de resultaten worden als FPR en kan dus worden aangepast aan de behoeften van de patiënt. Trofile resultaten, daarentegen, zijn gewoon R5 of X4 rapporten en toegang tot de ruwe data niet gegeven.
Op dit moment, de Europese richtlijnen suggereren een FPR cut-off van 20% 10, terwijl de Oostenrijks-Duitse richtlijnen laten de aanpassing van het FPR cut-off specifiek aan de behoeften van elke patiënt 11. In deze lijn, voor patiënten met een breed scala van antiretrovirale geneesmiddelen opties, hogere FPR cut-offs (> 20%) zijn aanbevelingbeëindigd. Daarentegen voor zwaar voorbehandelde patiënten met een beperkte therapeutische opties, lagere FPR cut-offs (> 5%) worden gebruikt. Deze vorm van therapie begeleiding is momenteel aan de gang door de weerstand testen om NRTI's, NNRTI's, PI's, en Inis, waar een deel-actieve geneesmiddelen kunnen worden opgenomen in de behandeling van patiënten met een verminderde therapeutische opties. Bovendien, met een groeiend aantal genotypisch-begeleide therapie veranderingen, de klinisch relevante FPR cut-offs worden voortdurend bijgesteld door een panel van bio-informatici, virologen en clinici.
Een ander belangrijk voordeel van de genotypische tropisme testen is de mogelijkheid te analyseren klinische monsters met zeer lage of niet detecteerbare viral load (VL). In deze gevallen, wanneer plasma RNA niet amplificeerbaar is, kan het provirale DNA gesequeneerd worden en gebruikt voor betrouwbare voorspellingen 9,12. Van de nota, is het aantal patiënten met een lage of niet detecteerbare viral load sterk toegenomen in de laatste jaren. Tot dusverre heeft de Trofiel test laat alleen de analyse van monsters van patiënten met VL <1000 kopieën / ml. Echter hebben voorlopige studies aangetoond dat proviraal DNA kan ook worden adecuate worden getest door Trofile 13.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs worden gefinancierd uit de Corus, MedSys Cell Entry, ketting en Resina projecten.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Diagnostics | 04 802 993 001 | |
MagNA Pure Compact System | Roche Diagnostics | 03731146001 | |
T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |