Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

O protocolo está resumida na fig. 4. 1. Coleta de amostras de sangue Recolher, pelo menos, 3 ml de sangue em tubos de EDTA no local da clínica. As amostras podem ser armazenadas até uma semana a 4 ° C. Encaminhar as amostras de sangue EDTA-o mais rapidamente possível para o laboratório por correio normal. 2. O isolamento de RNA do HIV e / ou DNA Obter o RNA viral e / ou de ADN a partir de 1000 uL de sangue total, soro ou plasma, utilizando-se o isolamento do ácido Magna Pure Compact Nucleic I kit I e do Sistema Pure Magna Compacto. Eluir o RNA ou DNA obtido em 50 ul de tampão TE. Alternativamente, outros processos de ácidos nucleicos de purificação podem ser usados. 3. A amplificação da região env Amplificação da região env (Figs. 2 e 4) a partir de plasma ou de ARN ou ADN proviral. Um produto de 1245 pb de comprimento, que compreende a maior parte da proteína Env (nt 6556-7811 according de HXB2) é gerado. As amostras de RNA: RT-PCR da reacção RNA viral apresenta uma estrutura muito complexa secundária (Fig. 4) que podem impedir a reacção de RT. Para evitar este problema, incubar 10 ul de RNA a 65 ° C durante 10 minutos (já no tubo de PCR e na máquina de PCR) e em seguida reduzir a temperatura a 50 ° C. Adicionar 40 ul da PCR Master Mix incluindo os iniciadores Env-F e Env-R. Mix Master para RT-PCR In-House System: volume / reacção (ul) concentração final RNase H 2 O 14,4 Tampão de 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 10 1x 5x solução de Q- 10 1x dNTP Mix (10 mM cada) <td> 2 400 uM de cada dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 2 Primer Env-F (100 uM) 0,3 0,6 uM Primer Env-R (100 uM) 0,3 0,6 uM Inibidor de RNase (RNasin) 1 5 unidades / reação Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 de acordo com HXB2) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) Executar a reacção de RT a 50 ° C durante 30 minutos. Executar a primeira PCR como se segue: 95 ° C, 15 min 1 x 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min </td> 1 x 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min 38 x 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ As amostras de DNA: reacção de PCR Para as amostras de ADN proviral, nenhuma reacção de RT inicial é necessária, e a reacção de PCR pode iniciar directamente. Adicionar 40 ul de PCR Master Mix para 10 ul de DNA provial. Mix Master para PCR In-House System: volume / reacção (ul) concentração final RNase H 2 O 15,4 Tampão de 5x (HotStarTaq ADN Polimerase) 10 1x 5x solução de Q- 10 1x dNTP Mix (10 mM cada) 2 400 uM de cada dNTP Enzym-Mix (HotStarTaq ADN Polimerase) 2 Primer Env-F (100 uM) 0,3 0,6 uM Primer Env-R (100 uM) 0,3 0,6 uM Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) Executar as condições de PCR como descrito anteriormente para as amostras de ARN (Passo 3.1.4). 4. A amplificação da região V3: PCR aninhada Para a PCR aninhada, usar 5 ul a partir da primeira reacção de PCR (sem análise anterior, em gel de agarose) como modelo e adicionar 95 ul de PCR MasMisture ter. Mix Master de Nested-PCR In-House volume / reacção (ul) concentração final H 2 O 61,9 Tampão de PCR 10x 10 1x 5x solução de Q- 20 1x dNTP Mix (10 mM cada) 2 200 uM de cada dNTP Primer Env-2F (100 uM) 0,3 0,6 uM Primer Env-2R (100 uM) 0,3 0,6 uM HotStarTaq ADN Polimerase 0,5 2,5 unidades / reacção Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864) <strong> Env-2R: 5'-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3 '(nt 7712 ← 7742) Executar a PCR como se segue: 93 ° C, 15 min 1 x 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg 1 x 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg 43 x 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ Analisar o produto de PCR num gel de agarose a 1% (Fig. 4). O produto esperado é 902 bp de comprimento. A purificação das amostras de sequenciação. Purifica-se o produto de PCR com o kit Qiagen PCR Purification, utilizando-se o protocolo, soluções e micro-colunas fornecidas pelo fornecedor. Eluir em 30-100 ul de tampão PE, dependendo da intensidade da banda. Alternativamente, as amostras podem ser purificados utilizando ExonucleaseI e Fast AP (Thermo fosfatase alcalina). Para este fim, adicionar 6 Mix Exo-AP a 15 uL do produto de PCR e incubar 15 minutos a 37 ° C. 580 ul de H2O 66 ul AP rápido 13,4 Exo ul eu 5. Reação seqüência do amplicon V3 A reacção consiste em uma sequência de reacção de PCR, utilizando um dos seguintes iniciadores: Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980) Env-5: 5 '-AAAATTCCCCTCCACAATTA – 3' (nt 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC – 3 '(nt 6979 → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC – 3 '(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC – 3' (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC – 3' (nt 7638 ← 7664) Iniciadores de primeira escolha são: Env-2, 6 ou Env-Env-7, Env-11 Use 1 ul do fragmento amplificado V3 purificado como modelo e adicionar 9 ul de PCR mestre de mistura. Sequenciamento Mix Master: 4 ul mistura de sequência (HIV-Genotipagem Kit) 4 ul de H2O Um Primer ul (100 pmol / pL) Executar a sequência de reacção como se segue: 96 ° C, 10 seg 50 ° C, 10 seg 36 x 60 ° C, 45 seg 4 ° C ∞ 6. A purificação das amostras de sequenciação Purificar seqüências using Sephadex G-50 superfina. Encher o número adequado de poços no "carregador coluna" com Sephadex G-50 superfina. Transfira o Sephadex ao MAHVN4510 placa de filtro virando. Adicionar 300 ul de água Milli-Q H 2 O a cada poço na placa de filtro, e incubar-lo durante pelo menos 3 horas a 2-8 ° C. Centrifugar as placas durante 5 min a 910Xg e 4-15 ° C. Descartar o fluxo através. Adicionar 10 ul de H 2 O para o produto de sequência e, em seguida, a sequência da pipeta na placa de Sephadex incharam. Para obter o produto purificado, centrifugar a placa durante 5 min. em 910Xg e 4-15 ° C e recolher o fluxo através. 7. A sequenciação das amostras purificadas no sequenciador ABI Prism 3130 XL Antes de cada corrida, mudar o tampão e verificar o volume do polímero (POP7). Se necessário, substituir o polímero frasco velho por um novo. Use as condições de execução salvas, incluindo um tempo de injeção de 18 segundos. Nesta máquina, a recolha de dados de sinal de uma experiência com 16 amostras de sequências leva cerca de 60 minutos (36 cm capilar) ou 150 minutos (50 cm capilar). 8. Edição seqüência Usar o programa Lasergene (DNA-Star) para alinhar e editar as sequências (Fig. 5). Outros programas de edição de sequências pode ser utilizado. Utilizar um "B-V3 Consenso" e a sequência de consenso env como referências. Lasergene cria uma sequência de consenso da amostra analisada utilizando todos os dados em bruto disponíveis, e armazená-lo como um ficheiro FASTA. O ficheiro FASTA é um ficheiro de texto que inclui um cabeçalho com o nome da amostra e da sequência de nucleótidos. 9. Sequenciamento interpretação de dados e previsão tropismo Sequenciação de interpretação dos dados é realizada pelo sistema de interpretação com base na web geno2pheno [coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Para a predição tropismo, configurações de FPR diferentes podem ser seleccionados. A configuração padrão é de acordo com as diretrizes germano-austríaca de terapia. Para FPR ≥ 20%, o vírus é classificado como R5 quando FPR ≥ 20% e X4 para FPR <12,5%. Carregar o arquivo FASTA no servidor. Este servidor traduz a sequência de nucleótidos em aminoácidos, alinha-o com a sequência de consenso V3-B e produz uma classificação de subtipo. Além disso, ele gera uma previsão da utilização co-receptor (Fig. 4), expresso como a taxa de falso positivo (FPR). 10. Resultados representativos O geno2pheno [coreceptor] saída mostra uma interpretação graduada do tropismo. Dependendo da probabilidade de o uso co-receptor, a interpretação de texto e a cor do fundo que varia do verde (<20% FPR), sugerindo uma administração segura de MVC, a amarela, sugerindo um risco, baixa possível e, finalmente, para o vermelho. Vermelho é a cor sugeremção não prescrever MVC. Além disso, o servidor gera um relatório pdf que pode ser impresso, preenchido com o paciente e os dados de amostra, e enviada para o médico. Exemplos de saída geno2pheno [coreceptor] estão representados na Fig. 6. Figura. 1. Replicação esquemática de HIV. O virião deve ligar-se às células CD4 como receptor celular e tanto ao CCR5 ou CXCR4 como co-receptor. O co-receptor CCR5 pode ser bloqueado com os antagonistas do CCR5 como Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Após a fusão das membranas viral e celular, o nucleocapsídeo viral é libertado no citoplasma. A nucleocápside desmonta e do complexo de RNA viral é libertado para dentro do citoplasma. A transcriptase reversa virai (RT) transcreve o ARN genómico em ADN proviral, que é, então, transportado para o núcleo e integrado no genoma do hospedeiro pela integrase HIV. Cellular RNA polimerases transcribe genoma viral e RNA mensageiro a partir do genoma proviral. As proteínas virais são produzidas no citoplasma e transportada para a superfície celular. O vírus bud partículas como imaturas, não infecciosas viriões a partir das células. A protease de HIV cliva as proteínas produtoras de partículas infecciosas. A inibição de um dos passos leva a uma interrupção do ciclo de replicação. As drogas anti-retrovirais e o passo que eles inibem a replicação são marcados a vermelho. O RNA viral e DNA proviral (material utilizado para a análise tropismo ou resistência) estão marcados a verde. A Figura 2. HIV genoma proviral. A partícula de HIV é construído com diferentes proteínas estruturais e enzimas diversas casas e proteínas, tanto de origem viral e celular. O show figuraé a localização dos genes dentro do genoma viral. A superfície de proteínas gp120 e gp41 constituem pontas sobre a superfície do virião e contactar a célula humana para realizar a fusão da membrana. Na parte inferior da figura, os produtos de amplificação por PCR e os iniciadores utilizados no nosso protocolo são mostrados. Figura 3. Proporção de pacientes com carga viral baixa (VL) medidas analisadas para resistência a drogas ou determinação do tropismo no Instituto de Virologia da Universidade de Colônia (Alemanha). Figura 4. Esquema geral do experimento .. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Sequência de edição com Lasergene. O amplicon V3 é sequenciado com, pelo menos, um para a frente e um iniciador inverso. Lasergene alignes os "ABI". Arquivos obtidos no seqüenciador com a referência de seqüências "Consenso V3-B" e env. Lasergene cria uma seqüência consenso com todos os dados da linha disponíveis. As sequências de referência podem ser marcados (e, em seguida, são apresentados a cinzento), de modo que não contribuem para a sequência de consenso da amostra. Figura 6. Tropismo relatórios de previsão gerados pelo geno2pheno [co-receptor] relatórios tool.The são gerados como arquivos PDF que podem ser salvos e preenchidos no computador. Dados adicionais nome do paciente nos tal, a data de extração de sangue, etc, podem ser incluídos manualmente usando um programa de escritor pdf. Comentários específicos também podem ser adicionados. Tsdados electrónicos são exclusivamente no computador do utilizador, e não sobre a [coreceptor] geno2pheno servidor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.