Die Vorhersage des Korezeptor Nutzung von HIV-1 ist für die Verwaltung einer neuen Klasse von antiretroviralen Medikamenten, dh Korezeptor-Antagonisten erforderlich. Es kann durch Sequenzanalyse die durchgeführt werden<em> Env</em> Gens und anschließende Interpretation durch eine Internet-basierte Interpretation Systems (geno2pheno<sub> [Korezeptor]</sub>).
Maraviroc (MVC) ist der erste lizenzierte antiretrovirale Medikament aus der Klasse der Korezeptor-Antagonisten. Es bindet an den Host Korezeptor CCR5, das von der Mehrzahl der HIV-Stämme verwendet, um die humanen Immunzellen (Abb. 1) zu infizieren. Andere HIV-Isolate eine andere Korezeptor, die CXCR4. Welcher Rezeptor verwendet wird, wird in dem Virus vom Env-Protein (Fig. 2) bestimmt. Abhängig von der Korezeptor verwendet, werden die Viren als R5 oder X4, bzw. klassifiziert. MVC bindet an den CCR5-Rezeptor Hemmung der Eintrag von R5 Viren in die Zielzelle. Im Verlauf der Erkrankung kann X4-Viren entstehen und wachsen die R5-Viren. Bestimmung der Korezeptor Nutzung (auch als Tropismus) ist daher zwingend vor der Verabreichung von MVC, wie EMA und FDA gefordert.
Die Studien für MVC Effizienz MOTIVATE MERIT und 1029 wurden mit dem Trofile Assay von Monogram, San Francisco, USA durchgeführt Dies ist ein qualitativ hochwertiges Assay basierend auf sophisorgfältigster Bearbeitung rekombinanten Tests. Die Akzeptanz für diesen Test für die tägliche Routine ist eher gering außerhalb der USA, da die europäischen Ärzten eher mit dezentralen Experten Labors, die auch gleichzeitige Resistenztestung meidet. Diese Laboratorien haben mehrere Qualitätssicherung Auswertungen, die letzte in 2011 1 präsentiert unterzogen.
Seit einigen Jahren haben wir Tropismus Bestimmungen basierend auf Sequenzanalyse von der HIV env-V3-Genregion (V3) 2 durchgeführt. Diese Region trägt genügend Informationen, um eine zuverlässige Prognose durchführen. Die genotypische Bestimmung der Korezeptor Nutzung stellt Vorteile wie: kürzere Umschlagszeit (entspricht Resistenztestung), niedrigere Kosten, die Möglichkeit, die Ergebnisse an die Bedürfnisse der Patienten anzupassen und die Möglichkeit der Analyse von klinischen Proben mit sehr geringer oder gar nicht nachweisbare Viruslast (VL ), zumal die Zahl der Proben mit VL analysiert <1000 Kopien / uletwa in den letzten Jahren erhöht (Abb. 3).
Die wichtigsten Schritte für Tropismus-Tests (Abb. 4) zeigt in diesem Video:
Ein. Sammeln einer Blutprobe
2. Isolierung der HIV-RNA aus dem Plasma und / oder HIV proviralen DNA aus mononukleären Blutzellen
3. Amplifikation des env-Bereich
4. Amplifikation der V3-Region
5. Sequenzreaktion des V3 Amplikon
6. Aufreinigung der Sequenzierungsproben
7. Sequenzierung der gereinigten Proben
8. Sequence Editing
9. Sequenzierung Dateninterpretation und Tropismus Vorhersage
Die V3-Sequenz erlaubt eine zuverlässige virale Tropismus Vorhersage, wie in klinischen Studien 3-9 gezeigt. In der Tat ist genotypischen Bestimmung in der geltenden europäischen und deutsch-österreichischen Richtlinien 10 vorgesehen.
Verglichen mit phänotypischen Testung, wird nicht nur die Zeit, die kürzer Umsatz (entspricht Resistenztestung), sondern auch die Kosten. Darüber hinaus ist ein großer Vorteil der genotypischen Tests, dass die Ergebnisse als FPR werden benotet und kann daher auf die Bedürfnisse der Patienten angepasst werden. Trofile Ergebnisse, auf der anderen Seite, sind einfach R5 oder X4 Berichten und den Zugang zu den Rohdaten wird nicht gegeben.
Derzeit deuten die europäischen Richtlinien eine FPR Cut-off von 20% 10, während die österreichisch-deutschen Richtlinien zur Anpassung der FPR cut-off speziell für jeden Patienten die Bedürfnisse 11 zu ermöglichen. In dieser Linie für Patienten mit einem breiten Spektrum von antiretroviralen Medikamenten Möglichkeiten, höhere FPR cut-offs (> 20%) sind empfbeendet. Umgekehrt bei stark vorbehandelten Patienten mit begrenzten therapeutischen Optionen unteren FPR cut-offs (> 5%) verwendet werden. Diese Art der Therapie Führung ist derzeit laufenden durch den Widerstand testet den NRTIs, NNRTIs, PIs und INIs, wo teilweise wirksamen Arzneimitteln in der Behandlung von Patienten mit eingeschränkter therapeutischer Optionen enthalten sein können. Darüber hinaus mit der wachsenden Zahl von genotypisch-gestützte Therapie Veränderungen, die klinisch relevanten FPR cut-offs werden ständig von einer Jury aus Bioinformatiker, Virologen und Mediziner eingestellt.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der genotypischen Tropismus Tests ist die Möglichkeit zur Analyse klinischer Proben mit sehr geringen oder gar Viruslast (VL). In diesen Fällen, wenn Plasma RNA nicht amplifizierbare kann der Provirus-DNA sequenziert werden und für zuverlässige Vorhersagen 9,12. Zu beachten ist, ist die Zahl der Patienten mit niedrigen oder nicht nachweisbaren Viruslast stark in den letzten Jahren zugenommen. Bis heute hat die Trofile Assay erlaubt nur die Analyse von Proben von Patienten mit VL <1000 Kopien / ml. Allerdings haben Voruntersuchungen gezeigt, dass Provirus-DNA kann auch sein adecuate durch Trofile 13 getestet werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind von der Corus, MedSys Zelleintritt, Kette und Resina Projekte finanziert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Diagnostics | 04 802 993 001 | |
MagNA Pure Compact System | Roche Diagnostics | 03731146001 | |
T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |