1. Preparazione di cateteri e Antenna del mouse per l'accesso di campionamento (MASA tm) Preparare un catetere arterioso inserendo un pezzo di 1,3 cm di PE-10 (0,011 pollici di diametro interno) in un pezzo di 6 cm di tubo silastic (0,012 pollici di diametro interno) come mostrato nella Figura 1A. Smussare la punta del PE-10 con un bisturi così la lunghezza a partire dalla fine del silastic alla punta dello smusso è di 0,9 cm. Preparare catetere venoso facendo scorrere un 1 pezzo di tubo silastic millimetri (0,020 pollici di diametro interno) 1,1 cm dalla fine smussato di un pezzo 6 cm di tubo silastic (0,012 pollici di diametro interno) come mostrato nella Figura 1B. Il 1 pezzo mm di silastic viene utilizzato come contenimento tallone. Per preparare un tm MASA, inserire ciascuno dei due pezzi di 1,3 cm di 25 connettori in acciaio inox calibro in ciascuno dei due 3 pezzi cm di PE-20 (0,015 pollici di diametro interno). Fissare il PE-20/connectors l'un l'altro facendo scorrere un pezzo di 5 mm silastictubi (0,040 pollici di diametro interno) sopra l'area in cui i tubi di acciaio e PE-20 si incontrano. Piegare i tubi d'acciaio ad un angolo di ~ 120 ° e separare ogni tubo da ~ 45 °. Luogo completato impianto in un ciuffo di adesivo siliconico medici in modo che il tubo PE-20 è verticale e le estremità dei tubi in acciaio inossidabile si estendono oltre l'adesivo (Figura 1C). Permettere che questo set per 24 ore. 2. Cateterizzazione chirurgico Prima dell'intervento, sterilizzare cateteri con il 70% di etanolo, li riempiono con soluzione fisiologica eparinata (200 U eparina / ml soluzione salina) e inserire i tasselli in acciaio inox. Anestetizzare il mouse, preferibilmente utilizzando un metodo che fornisce continuamente l'agente anestetico (ad esempio isoflurano per via inalatoria). Usando la tecnica sterile, eliminare i peli dai siti di incisione con tagliaunghie e / o di una crema depilatoria e disinfettare la cute con alcool seguito da uno scrub Betadine. Per l'inserimento del catetere, rimuovere i peli sulregione che si estende dalla mascella inferiore alla parte superiore della gabbia toracica e tra le clavicole. Di esternalizzazione dei cateteri dietro la testa, rimuovere i capelli nella zona tra la base del cranio e della regione interscapolare e disinfettare la cute con alcool seguito da uno scrub Betadine. Posare il mouse sul dorso su una superficie di riscaldamento e sotto l'area di visualizzazione di un microscopio operatorio. Fissare la coda e le estremità con del nastro adesivo chirurgico. Fissare la testa nel cono consegnare l'anestesia. Fai una piccola incisione verticale mediana 5 millimetri cefalica allo sterno. Utilizzando pinze, smussato sezionare il tessuto per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistro. Riflettere questo muscolo per esporre l'arteria carotide sinistra. Stuzzicare delicatamente fuori dal tessuto connettivo l'arteria. E 'importante a questo punto per isolare il nervo vago dalla arteria senza danneggiare l'arteria e il nervo. Isolare l'arteria e legare le estremità cefalica con sutura di seta. Vagamente un altro nodopezzo di sutura alla fine caudale della nave esposta. Morsetto vaso con un micro-serrefine pinza sull'estremità caudale e tagliate appena sotto alla fine legatura con le forbici a molla. Inserire con cautela catetere fino al morsetto. Attentamente rilasciare il micro-serrefine morsetto e far avanzare il catetere al silastic-PE giunzione. Cravatta entrambe le legature in modo sicuro al catetere e confermare che i campioni catetere collegando l'estremità libera del catetere ad una siringa di campionamento. Fare un altro 5 millimetri incisione a destra della linea mediana e di circa 2 mm caudale alla prima incisione. Utilizzando pinze, smussato sezionare il tessuto per esporre ed isolare la vena giugulare destra. Attentamente legare alla fine cefalica con sutura in seta e cravatta vagamente un altro pezzo di sutura alla fine caudale. Tagliato appena sotto la legatura cefalica con le forbici a molla e inserire il catetere fino al contenimento tallone. Tie una sutura dietro il tallone e confermare che i campioni del catetere. Turn il mouse sopra e fare una piccola incisione tra le scapole. Tunnel un 14-gauge sotto la pelle dall'incisione per il catetere arterioso, sulla parte anteriore del mouse, per l'incisione interscapolare sul retro. Infilare il catetere arterioso attraverso l'ago di esternare la parte posteriore del mouse. Ripetere questa operazione per il catetere giugulare mediante il tunneling del 14-gauge sotto la pelle sul lato destro del mouse dal sito incisione sulla parte anteriore per l'incisione interscapolare sul retro. Bloccare il catetere arterioso con un micro-serrefine morsetto al sito di incisione tra le scapole. Tagliare il catetere ~ 1 cm sopra il morsetto. Posizionare il tm MASA con i connettori in acciaio inox rivolto verso la testa del topo. Collegare il catetere arterioso al connettore in acciaio inox puntato verso il lato sinistro del mouse. Aver cura di garantire non ci sono buchi o pieghe nel catetere. Ripetere l'operazione per il catetere venoso,collegarlo al connettore in acciaio inox che punta verso il lato destro del mouse. Inserire il tm MASA nel incisione tra le scapole. I tubi in PE-20 corrispondente al catetere giugulare dovrebbe essere sul lato destro del mouse e il tubo PE-20 corrispondente al catetere arterioso dovrebbe essere quello di sinistra. Chiudere le incisioni ventrale e dorsale con sutura in nylon. Per la chiusura dorsale, la sutura può essere eseguito attraverso il silicone indurito del tm MASA per fissarlo in posizione. Confermare la pervietà dei cateteri utilizzando una soluzione di lavaggio contenente soluzione salina eparinizzata e un antibiotico per ridurre al minimo il rischio di infezione. Del mouse in un luogo riscaldato, gabbia pulita per il recupero immediato. La figura 2 mostra il prodotto finito. Lasciare il mouse per recuperare per almeno 5 giorni. Controllare il peso e la salute generale. Utilizzare l'appropriato post-operatorio regime analgesico come approvato dalla cura degli animali dell'istituzione eUsa comitato. 3. Iperinsulinemico euglicemico-clamp Veloce il mouse per 5-6h. Come riferimento, il tempo t = 0 min si riferisce alla fine del digiuno e l'inizio della infusione di insulina e glucosio (cioè periodo il morsetto). La linea di impostazione e il tempo per un tipico esperimento sono illustrati nella Figura 3. Utilizza tubi micro-Renathane o equivalente per infusione e le linee di campionamento. Sospendere un dual-channel girevole sopra il mouse. Questo serve come un hub tra il mouse e infusione / campionamento siringhe. Durante l'esperimento, il mouse rimane a casa in una gabbia o contenitore simile ed è legato alla rotazione. Prima di collegare il mouse, riempire la linea arteriosa di campionamento con soluzione fisiologica eparinata (10 U eparina / ml soluzione salina) e inserire un connettore in acciaio inox, alla fine della linea di fondo. Lascia una siringa con soluzione fisiologica eparinata (clearing siringa) collegata alla parte superiore della linea di campionamento. Questo sarà utilizzato per redigere il sangue samples. Riempire la linea di infusione venosa con non eparinizzati salina a partire dal porto di infusione della girevole (segmento A in figura 3a) fino alla parte inferiore della linea. Inserire l'estremità superiore della linea e il luogo di un connettore in acciaio inossidabile (o di un connettore a Y se un bolo deve essere somministrato) alla fine della linea di fondo. Se un tracciante al glucosio isotopica (ad esempio [3 – 3 H] glucosio) viene infusa, garantire una siringa da 1 ml contenente il tracciante di una siringa di infusione. Riempire la linea di infusione venosa con tracciante al posto di soluzione salina (Figura 3B). Tre ore nel veloce, pesare il mouse e collegare il PE-20 per la vena giugulare e cateteri arteriosi per l'infusione e linee di campionamento, rispettivamente. Se l'amministrazione [3 – 3 H] glucosio tracciante, iniziare una mano di fondo-infusione continua tracciante al tempo t = -90 min (Figura 3C). Una tipica dose primaria è di 1 μCi. Preparare un 0,05 μCi / mL [3 – 3 H] glucosio solution non eparinizzati salina. Caricare la soluzione in una siringa da 1 ml e fissare la siringa in una pompa di infusione. Somministrare la dose primaria infondendo 20 l / min per 1 min. Seguire con una infusione continua di 0,05 μCi / min (1 ml / min) per un periodo di 90 minuti di equilibrio. Preparare sostanze infuse di insulina e glucosio. L'insulina viene preparato in non eparinizzati salina contenente il 3% del plasma come un vettore (un'adeguata concentrazione di BSA può anche essere utilizzato). Sostanze infuse glucosio sono disponibili in commercio in diverse concentrazioni (% 5, 20 e 50). Preparare soluzione salina lavato infusate erythorocyte ottenendo sangue intero da un topo donatore, preferibilmente dello sfondo stesso ceppo, come il mouse sperimentale. Tipicamente 1 ml di sangue intero è necessaria per lo studio del mouse. Centrifugare il sangue agli eritrociti separati. Lavare eritrociti con 10 U / ml soluzione salina eparinata e centrifugare a scartare la soluzione salina. Determinare il volume degli eritrociti e risospendere in un volume uguale di 10 U / ml heparisciuta salina. Disegnare ogni infusate in una siringa da 1 ml e sicuro ogni siringa per una pompa per infusione individuale. Collegare ogni siringa ad un connettore a 4-vie (Figura 3). A t = -15 min prendere un campione di sangue lentamente redazione 50-100 ml di sangue nella siringa radura. Fissare la linea arteriosa campionamento e rimuovere la siringa di compensazione. Usando un portatile glucometro, prendere una lettura di glucosio nel sangue, rimuovendo la pinza sulla linea di campionamento arteriosa e permettendo al sangue di fluire nella striscia misuratore di glucosio. Una volta che la misurazione del glucosio è presa, morsetto linea arteriosa campionamento e inserire un brusco-ago della siringa (siringa di campionamento) nella linea di campionamento arteriosa. Rimuovere il morsetto e disegnare un volume di sangue (vedi nota) nella siringa di campionamento. Fissare la linea arteriosa campionamento e rimuovere la siringa di campionamento. Inserire la siringa di compensazione indietro nella linea di campionamento arteriosa. Redigere lo stantuffo per eliminare eventuali bolle d'aria e re-infondere il50-100 ml di sangue che è stato originariamente disegnato. Nota: il volume di sangue campionato dipende dalle analisi in corso. Per esempio, l'analisi di [3 – 3 H] concentrazione di glucosio richiede 10 ml di plasma, quindi 50 ml di sangue sono tratte. Questo produce 20-30 ml di plasma, che è sufficiente per l'analisi più al plasma aggiuntive, se necessario. Misure di ormoni e altri metaboliti (ad esempio l'insulina, gli acidi grassi liberi) richiedono il campionamento di sangue aggiuntivo. Dispensare il sangue nella siringa di campionamento in un EDTA rivestite microprovette. Centrifugare e raccogliere il plasma. Mantenere il plasma in ghiaccio fino alla fine dello studio o immediatamente conservare a -20 ° C. Ripetere i passi da 3,12 a 3,10 con t = -5 min. Ottenere ulteriori sangue (50 ml) per la misurazione dei livelli plasmatici basali di insulina. Misurare ematocrito al basale da un prelievo di sangue in una provetta con eparina o EDTA trattati capillare. Le misurazioni ottenute from campioni di plasma al tempo t = -15 e -5 min rappresentano basale (a digiuno per esempio) valori. Dopo che il campione al tempo t = -5 min, riempire le linee di infusione di emazie di glucosio, insulina e salso-lavato fino al connettore a 4 vie. Collegare il connettore a 4 vie per il tubo collegato alla porta girevole infusione (o il tubo collegato al connettore a Y se infondendo [3 – 3 H] glucosio) come mostrato in Figura 3. Iniziate versando la soluzione salina-eritrociti lavati prima. Impostare la velocità di infusione per sostituire il volume totale del sangue che viene campionata per tutta la durata dello studio (ad esempio se un totale di 500 ml di sangue sono campionati oltre 120 minuti di studio, impostare la velocità di infusione a 4,2 microlitri / min). A differenza della altre sostanze infuse, la soluzione degli eritrociti è di colore rosso. Infondendo questa soluzione consente prima di qualsiasi potenziale resistenza o ostruzioni nelle linee di infusione di essere identificati e corretti. Una volta che il infusate eritrociti raggiunge il mouse, avviare l'insulina einfusioni di glucosio. Questo è ora t = 0 min. L'insulina è infuso in una costante, pre-determinata tariffa. Una velocità di infusione di insulina di 4 mU • • kg -1 min -1 in genere sopprimere la produzione endogena di glucosio da 80-100% e stimolare la scomparsa di glucosio dal 2-3 volte. L'iniziale velocità di infusione di glucosio (GIR) è stimato in base ai livelli basali di glucosio nel sangue e precedente esperienza. Se infondendo [3 – 3 H] glucosio, si può scegliere di aumentare la velocità di infusione del tracciante per soddisfare l'aumento stimato del fatturato glucosio (tipicamente un aumento di 2-3 volte). Considerando l'alto tasso di turnover del glucosio nel topo, i campioni di sangue sono ottenuti dalla linea arteriosa non meno di ogni 10 min per la misurazione della concentrazione di glucosio per tutta la durata dell'esperimento. Regolare il GIR per raggiungere e mantenere euglicemia bersaglio (Figura 3C). Questo obiettivo può variare a seconda del modello o le finalità dello studio. Un buon obiettivo glucose concentrazione è di 150 mg • dL-1 dal momento che questo è un tipico livello di 6h di glucosio a digiuno per un chow-fed C57BL/6J del mouse. L'obiettivo è quello di raggiungere rapidamente euglicemia, idealmente entro i primi 40-50 minuti, e di avere glucosio e stabile GIR entro l'inizio del periodo di steady-state (t = 80 min). Se infondendo [3 – 3 H] glucosio, ottenere ulteriori sangue al tempo t = 80, 90, 100, 110 e 120 minuti per la misura di plasma [3 – 3 H] glucosio attività specifiche. Raccogliere il sangue aggiuntivi al tempo t = 100 e 120 minuti per la misura di insulina plasmatica e qualsiasi altro ormone (s) o metabolita (s). T = 110 min, prelievo di sangue in una provetta con eparina o EDTA trattati capillare per la misurazione del morsetto ematocrito. Dopo che il campione al tempo t = 120 min è preso, 2 [14 C] desossiglucosio può essere somministrato per la misurazione del tessuto-specifiche glucosio. Amministrare un 12 μCi bolo nella linea bolo collegato alla linea di campionamento giugulare (Figura 3B </strong>). Ottenere campioni di sangue (50 ml) dalla linea di campionamento arteriosa al tempo t = 2, 15, 25 e 35 minuti dopo la somministrazione del bolo per la misurazione di plasma 2 [14 C] desossiglucosio livelli. Dopo l'ultimo campione, anestetizzare il mouse con una infusione di pentobarbital dato direttamente nella linea arteriosa. Dissezionare rapidamente di qualunque tessuto necessario per la valutazione di assorbimento di glucosio (ad esempio muscoli scheletrici di vario tipo, tessuto adiposo, cuore, cervello) ed eventuali altri tessuti (es. fegato, milza, reni). Snap tessuti congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi. Glucosio tessuto viene analizzato misurando l'accumulo di fosforilato 2 [14 C] desossiglucosio nei tessuti congelati e la scomparsa di 2 [14 C] desossiglucosio dal plasma. 4. Rappresentante Risultati Un esempio dei risultati ottenuti da un esperimento pinza insulina è mostrato in Figura 4.Questo esempio mostra la capacità di una dieta ricca di grassi per l'insulino-resistenza precipitare nei topi. Tutte le presentazioni dei risultati pinza insulina deve includere le seguenti essere interpretabile: un corso di tempo dei livelli di glucosio nel sangue, un corso di tempo dei GIR e dei livelli di insulina plasmatica (linea di base e morsetto). Come mostrato qui, glicemia a digiuno (Figura 4A) e insulina (Figura 4C) i livelli sono più alti nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi, indicativo di insulino-resistenza. Presentazione di un corso di tempo dei livelli di glucosio nel corso dello studio morsetto (Figura 4A) permette al lettore di valutare come euglicemia stata mantenuta, il che è indicativo della qualità del morsetto. Allo stesso modo, un corso momento del GIR (Figura 4B) permette al lettore di determinare quanto rapidamente una steady-state è stato raggiunto. La manifestazione di questi dati come corsi di tempo è molto più informativo rispetto alla pratica tradizionale nella letteratura morsetto insulina topo di presentare un esperimento di 2 orecome un punto di riferimento unico che rappresentano i valori medi di un indefinito periodo di "pinza" (4-13). Nel presente esempio, i livelli di glucosio erano uguali tra il controllo e alto contenuto di grassi alimentati i gruppi, ma il GIR era significativamente più basso nel settore high-grasso nutrito gruppo (Figura 4B). Questo è indicativo di un danno in tutto il corpo l'azione dell'insulina. Morsetto livelli di insulina sono stati anche maggiori nel settore high-grasso nutrito gruppo (Figura 4C), sostenendo ulteriormente la presenza di un fenotipo insulino-resistente in questi topi. L'uso di infusi traccianti isotopici permette per la valutazione della azione dell'insulina in tessuti specifici. [3 – 3 H] glucosio viene utilizzato per stimare il tasso di comparsa di glucosio endogeno (Endora), che è un indice della produzione epatica di glucosio (HGP) e il tasso di tutto il corpo la scomparsa di glucosio (Rd). Mentre l'insulina sopprime completamente HGP nei topi di controllo, questo è alterata nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (Fig. 4D). Allo stesso modo, la capacità di inSulin per stimolare la Rd in topi di controllo è compromessa nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (4E Figura). 2 [14 C] desossiglucosio viene usato per valutare l'indice del metabolismo del glucosio (Rg), una misura di tessuto-specifica l'assorbimento del glucosio. Come si è visto in questo esempio, insulino-stimolato l'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è alterata nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (4F Figura). Figura 1: Preparazione della arteriosa (A) e (B) cateteri venosi e (C) MASA tm. Cateteri arteriosi sono preparati inserendo un pezzo di 1,3 cm di PE-10 di circa 3 mm in un pezzo 6 cm di 0,012 "silastic ID. Il PE-10 punta è smussato in modo che la lunghezza dalla coppia conica al silastic è di 0,9 cm. Venoso cateteri sono realizzati facendo scorrere un piccolo pezzo di 0.020 "ID silastic 1,1 centimetri dall'estremità smussata di un pezzo 6 cm di 0,012" silastic ID. I 0.020 "atti pezzo ID silastic come una goccia di ritenuta per sé curare il catetere alla vena giugulare. Per il montaggio del tm MASA, ciascuno dei due 1.3 cm 25-gauge connettori è inserito in ciascuno dei due 3 pezzi cm di PE-20. Queste sono tenute insieme da un piccolo pezzo di 0,040 "silastic ID. I connettori sono piegate ad un angolo di 120 ° e separati in un angolo di 45 °. L'intera assemblea è immerso in silicone medicale. Figura 2: mouse cateterizzati. Cateteri sono impiantato chirurgicamente nella arteria carotide sinistra e la vena giugulare destra. Le estremità libere dei cateteri sono esternalizzati dietro la testa e collegato ad un tm MASA. Il tm MASA viene inserito per via sottocutanea tra le scapole. Ciò permette un accesso vascolare durante gli esperimenti morsetto insulina senza la necessità di frenare, gestire o anestetizzare il mouse. jpg "/> Figura 3: Rappresentazione della linea di impostazione e il tempo per un esperimento pinza insulina. Il mouse è legato ad un doppio canale girevole che agisce come un hub per infusione e siringhe di campionamento. Configurazioni tipiche per gli esperimenti non usare infusioni tracciante (A) e utilizzando sia [3 – 3 H] glucosio e 2 [14 C] desossiglucosio (B) vengono visualizzati. Una linea del tempo di procedure per l'impostazione e l'esecuzione di insulina il morsetto (C) viene anche mostrato. Durante la pinza, i campioni di sangue ( ) Vengono effettuate ogni 10 minuti per misurare la glicemia. Il GIR è adeguato di conseguenza per mantenere euglicemia. I campioni di sangue di glucosio al basale, l'insulina plasma e plasma [3 – 3 H] glucosio sono prese a t = -15 e -5 min. I campioni di plasma morsetto [3 – 3 H] glucosio sono prese a t = 80, 90, 100, 110 e 120 e per l'insulina morsetto a t = 100 e 120 min. 2 [14 C] desossiglucosio è somministrata dopo il campione al tempo t = 120 min e blood viene raccolto a t = 2, 15, 25 e 35 minuti dopo. I tessuti sono prese dopo il t = 35 min campione. Figura 4: I risultati di un esperimento pinza insulina confrontando topi con una dieta di controllo (Chow) a topi con una dieta ricca di grassi (HFD). Durata di glucosio arteriosa (A) e di insulina GIR (B), al basale e morsetto (C), Endora (D), e Rd (E) e nel muscolo scheletrico (gastrocnemio e vasto laterale) Rg (F) sono mostrati. Tutti i risultati indicano l'effetto di alta alimentazione di grassi per indurre insulino-resistenza.