Hyperinsulinémique euglycémique-pinces dans Conscient, Souris illimités

1. Préparation de cathéters et d'antenne pour l'accès à l'échantillonnage de la souris (MASA tm) Préparer cathéter artériel en insérant un morceau de 1,3 cm de PE-10 (0.011 pouces de diamètre interne) dans un morceau de 6 cm de tube de silastic (0,012 pouces de diamètre interne) comme dans la Figure 1A. Biseau l'extrémité de la PE-10 avec un scalpel afin de la longueur de la fin de l'silastic à la pointe du biseau est de 0,9 cm. Préparer un cathéter veineux en glissant une pièce de 1 mm de tube en silastic (0,020 pouces de diamètre interne) 1,1 cm de l'extrémité biseautée d'une pièce de 6 cm de tube de silastic (0,012 pouces de diamètre interne) comme indiqué dans la figure 1B. La pièce de 1 mm de silastic est utilisé comme une retenue de billes. Pour préparer un tm MASA, insérez chacune des deux pièces 1,3 cm de 25 connecteurs en acier inoxydable de calibre dans chacun des deux 3 pièces cm de PE-20 (0.015 pouces de diamètre interne). Fixez le PE-20/connectors les uns aux autres en glissant une pièce de 5 mm de silastictube (0,040 pouces de diamètre interne) sur la zone où les tubes d'acier et PE-20 se rencontrent. Pliez les tubes d'acier à un angle de ~ 120 ° et séparer chaque tube par ~ 45 °. Placez complété plate-forme dans une cuillerée de colle silicone médical tel que le PE-20 tube est vertical et les extrémités des tubes en acier inoxydable au-delà de l'adhésif (figure 1C). Permettre que cette définir pour 24h. 2. Cathétérisme chirurgicale Avant la chirurgie, stériliser les cathéters à l'éthanol 70%, les remplir avec du sérum physiologique hépariné (200 U d'héparine / ml de sérum physiologique) et mettez les bouchons en acier inoxydable. Anesthetize souris, de préférence en utilisant une méthode qui fournit en permanence l'agent anesthésique (par exemple, l'isoflurane en inhalation). En utilisant une technique stérile, enlever les poils de sites d'incision utilisant une tondeuse et / ou une crème dépilatoire et désinfecter la peau avec de l'alcool suivi d'un gommage bétadine. Pour l'insertion du cathéter, enlever les poils sur lerégion qui s'étend de la mâchoire inférieure au sommet de la cage thoracique et entre les clavicules. Pour l'externalisation des cathéters derrière la tête, enlever les poils dans la zone entre la base du crâne et de la région interscapulaire et désinfecter la peau avec de l'alcool suivi d'un gommage bétadine. Posez la souris sur son dos sur une surface de réchauffement et sous la zone de visualisation d'un microscope chirurgical. Fixez la queue et les extrémités avec du ruban adhésif chirurgical. Fixez la tête dans le cône de nez offrant l'anesthésie. Faites une petite incision verticale médiane de 5 mm céphalique sur le sternum. En utilisant des pinces, émoussé disséquer les tissus pour exposer le muscle sterno-gauche. Refléter ce muscle pour exposer l'artère carotide gauche. Doucement taquiner hors des tissus conjonctifs de l'artère. Il est important à ce stade d'isoler le nerf vague de l'artère sans endommager ni l'artère ou du nerf. Isoler l'artère et ligaturer l'extrémité céphalique avec une suture de soie. Librement noeud autremorceau de suture sur l'extrémité caudale du navire exposé. Clamp navire avec une pince micro-serrefine à l'extrémité caudale et couper juste en dessous de la fin ligaturé avec des ciseaux à ressort. Insérez soigneusement cathéter aussi loin que la pince. Avec précaution la pince micro-serrefine et faire avancer le cathéter à la jonction de silastic-PE. Attachez deux ligatures solidement le cathéter et confirmer que les échantillons du cathéter en connectant l'extrémité libre du cathéter à une seringue de prélèvement. Faites une autre incision de 5 mm vers la droite de la ligne médiane et environ 2 mm caudal à la première incision. En utilisant des pinces, émoussé disséquer les tissus afin d'exposer et d'isoler la veine jugulaire droite. Soigneusement ligaturer l'extrémité céphalique avec une suture de soie et cravate vaguement un autre morceau de fil de suture à l'extrémité caudale. Coupez juste au-dessous de la ligature céphalique avec des ciseaux à ressort et insérez le cathéter jusqu'à la retenue de billes. Attachez un fil de suture derrière le talon et confirmer que les échantillons cathéter. Turn la souris et faire une petite incision entre les omoplates. Tunnel d'une aiguille de calibre 14 sous la peau de l'incision pour le cathéter artériel, sur le devant de la souris, à l'incision interscapulaire sur le dos. Enfiler le cathéter artériel par l'aiguille de l'extérioriser à l'arrière de la souris. Répétez cette opération pour le cathéter jugulaire par effet tunnel de l'aiguille de calibre 14 sous la peau sur le côté droit de la souris à partir du site de l'incision sur la face avant de l'incision interscapulaire sur le dos. Fixer le cathéter artériel avec une pince micro-serrefine au site d'incision entre les omoplates. Couper le cathéter ~ 1 cm au-dessus de cette pince. Placez le tm MASA avec les connecteurs en acier inoxydable tourné vers la tête de la souris. Connecter le cathéter artériel au connecteur en acier inoxydable pointé vers le côté gauche de la souris. Prenez soin de s'assurer qu'il n'ya pas de trous ou anomalies dans le cathéter. Répétez l'opération pour le cathéter veineux,le connecter au connecteur en acier inoxydable pointant vers le côté droit de la souris. Insérez le tm MASA dans l'incision entre les omoplates. Le tube PE-20 correspondant à la veine jugulaire du cathéter doit être sur le côté droit de la souris et le PE-20 tube correspondant au cathéter artériel doit être vers la gauche. Fermer les incisions ventrale et dorsale avec suture de nylon. Pour la fermeture dorsale, la suture peut être exécuté à travers le silicone trempé de la TM MASA pour le fixer en place. Confirmer la perméabilité des cathéters en utilisant une solution de rinçage contenant du sérum physiologique hépariné et un antibiotique pour minimiser le risque d'infection. Placez la souris dans un réchauffé, cage propre pour la reprise immédiate. La figure 2 montre le produit fini. Laissez la souris pour récupérer pendant au moins 5 jours. Surveiller le poids et la santé globale. Utiliser le post-opératoires appropriés régime analgésique, tel qu'approuvé par les soins des animaux de l'institution etUtilisez comité. 3. Hyperinsulinémique euglycémique-clamp Rapide de la souris pour 5-6h. Comme référence, le temps t = 0 min se réfère à la fin du jeûne et le début de la perfusion d'insuline et de glucose (c'est à dire la pince période). La ligne de temps d'installation et d'une expérience typique sont présentés dans la figure 3. Utiliser des tubes micro-Renathane ou équivalent pour l'infusion et les lignes d'échantillonnage. Suspendre un pivot double canal au-dessus de la souris. Ceci sert de plaque tournante entre la souris et perfusion / échantillonnage seringues. Pendant l'expérience, la souris reste dans une cage ou un récipient semblable et est attaché à l'émerillon. Avant de connecter la souris, remplissez la ligne d'échantillonnage artérielle avec une solution saline héparinée (10 U d'héparine / ml de sérum physiologique) et le lieu d'un connecteur en acier inoxydable à l'extrémité inférieure de la ligne. Laisser une seringue avec une solution saline héparinée (compensation seringue) connecté à la partie supérieure de la ligne d'échantillonnage. Il sera utilisé pour élaborer le sang SAMPERP. Remplissez la ligne de perfusion veineuse avec une solution saline non hépariné à partir du port d'infusion de l'émerillon (compartiment A de la figure 3A) tout le chemin vers le bas de la ligne. Branchez l'extrémité supérieure de la ligne et le lieu d'un connecteur en acier inoxydable (ou un raccord en Y si un bolus doit être administré) à l'extrémité inférieure de la ligne. Si un traceur isotopique du glucose (par exemple [3 – 3 H] glucose) est infusé, sécuriser une seringue de 1 ml contenant le traceur d'une seringue de perfusion. Remplissez la ligne de perfusion veineuse avec traceur au lieu de sérum physiologique (figure 3B). Trois heures dans le rapide, pesez de la souris et branchez le PE-20 pour la veine jugulaire et cathéters artériels à la perfusion et des lignes d'échantillonnage, respectivement. Si l'administration [3 – 3 H] traceurs du glucose, commencer une perfusion continue-traceur apprêté à t = -90 min (figure 3C). Une dose d'amorçage typique est 1 pCi. Préparer un pCi 0,05 / ul [3 – 3 H] glucose solution en non hépariné saline. Chargez la solution dans une seringue de 1 ml et sécuriser la seringue dans une pompe à perfusion. Administrer la dose d'amorçage en infusant 20 pl / min pendant 1 min. Suivre avec une perfusion continue de 0,05 pCi / min (1 pl / min) pour une période de 90 minutes d'équilibration. Préparer infusates de l'insuline et du glucose. L'insuline est préparé en non hépariné saline contenant 3% de plasma en tant que transporteur (une concentration appropriée de BSA peut également être utilisé). Infusates glucose sont commercialement disponibles dans une variété de concentrations (5%, 20 et 50). Préparer une solution saline lavés soluté erythorocyte par l'obtention de sang total d'un souris donneuse, de préférence de l'arrière-plan même souche que la souris expérimentales. Typiquement 1 ml de sang total est nécessaire par la souris d'étude. Centrifuger le sang d'hématies séparées. Laver les érythrocytes avec 10 U / ml de sérum physiologique hépariné et centrifugeuse pour éliminer la solution saline. Déterminer le volume de globules rouges et remettre en suspension dans un volume égal de 10 U / ml heparireconnu saline. Dessinez chaque soluté dans une seringue de 1 ml et sécuriser chaque seringue pour une pompe à perfusion individuels. Connectez chaque seringue à un connecteur à 4 voies (figure 3). A t = -15 min prélever un échantillon sanguin par lentement élaboration 50-100 ul de sang dans la seringue de compensation. Serrer la ligne d'échantillonnage artériel et retirer la seringue de compensation. En utilisant un glucomètre portatif, prendre une lecture de la glycémie en enlevant le collier sur la ligne de prélèvement artériel et permet au sang de circuler dans la bande de lecteur de glycémie. Une fois la mesure du glucose est prise, pince la ligne de prélèvement artériel et insérez une seringue à aiguille émoussée (seringue d'échantillonnage) dans la ligne de prélèvement artériel. Retirez la pince et tirer un volume de sang (voir note) dans la seringue de prélèvement. Serrer la ligne d'échantillonnage artériel et retirer la seringue de prélèvement. Insérer la seringue de compensation de nouveau dans la ligne de prélèvement artériel. Dresser sur le piston pour éliminer les bulles d'air et re-infuser le50-100 ul de sang qui a été établi initialement. Note: Le volume de sang prélevé dépend de l'analyse effectuée. Par exemple, l'analyse de [3 – 3 H] la concentration en glucose nécessite 10 ul de plasma, donc 50 pl de sang sont prélevés. Cela donne de 20 à 30 l de plasma, qui est suffisant pour l'analyse du plasma ainsi que d'autres si nécessaire. Mesures d'hormones et d'autres métabolites (par exemple l'insuline, les acides gras libres) exigent un échantillonnage de sang supplémentaire. Répartir le sang dans la seringue de prélèvement dans un microtube EDTA-enduit. Centrifuger et recueillir le plasma. Gardez le plasma sur la glace jusqu'à la fin de l'étude ou immédiatement conserver à -20 ° C. Répétez les étapes 3,10 3,12 travers à t = -5 min. Obtenir de sang supplémentaire (50 pi) pour la mesure des niveaux de référence du plasma insuline. Hématocrite de base Mesure par prise de sang dans un tube héparine ou EDTA-traitée capillaire. Les mesures obtenues frOM échantillons de plasma à t = -15 et -5 min représentent base (à jeun par exemple) des valeurs. Après l'échantillon à l'instant t = -5 min, remplissez les lignes de perfusion pour les érythrocytes de glucose, d'insuline et de solution saline échoués sur le connecteur à 4 voies. Branchez le connecteur à 4 directions pour le tuyau relié au port d'infusion pivotant (ou le tube connecté à la Y-connecteur si infusant [3 – 3 H] glucose) comme le montre la figure 3. Commencez infusant les érythrocytes de solution saline d'abord lavé. Réglez la vitesse de perfusion pour remplacer le volume total de sang étant prélevée sur la durée de l'étude (par exemple si un total de 500 pl de sang sont prélevés pendant 120 min de l'étude, réglez le débit de perfusion à 4,2 l / min). Contrairement à l'infusates autres, la solution d'érythrocytes est rouge. Infuser cette solution permet d'abord de toute résistance potentielle ou des obstructions dans les lignes de perfusion pour être identifiées et corrigées. Une fois que le soluté érythrocytes atteint la souris, commencer l'insuline etperfusions de glucose. Ceci est maintenant t = 0 min. L'insuline est perfusée à une constante, taux prédéterminé. Un taux d'insuline de 4 mU • kg -1 • min -1 sera généralement supprimer la production de glucose endogène par 80-100% et stimuler la disparition du glucose par 2-3 fois. Le taux de glucose initiale d'infusion (GIR) est estimée sur la base des niveaux de référence de la glycémie et de l'expérience précédente. Si infusant [3 – 3 H] glucose, on peut choisir d'augmenter le débit de perfusion traceur pour correspondre à l'augmentation estimée du chiffre d'affaires de glucose (généralement une augmentation de 2-3 fois). Considérant le taux élevé de roulement du glucose chez la souris, les échantillons sanguins doivent être obtenus à partir de la ligne artérielle au moins tous les 10 min pour la mesure de la concentration de glucose au cours de la durée de l'expérience. Ajustez le RIF pour atteindre et maintenir l'euglycémie cible (figure 3C). Cette cible peut varier selon le modèle ou les objectifs de l'étude. Une bonne cible glla concentration est de 150 mg ucose • dL-1 puisqu'il s'agit d'un niveau typique de 6h du glucose à jeun pendant une souris chow-alimentés C57BL/6J. L'objectif est de parvenir à euglycémie rapidement, idéalement dans le premier 40-50 minutes, et d'avoir du glucose et stable RIF par le début de la période d'état d'équilibre (t = 80 min). Si infusant [3 – 3 H] glucose, d'obtenir du sang supplémentaires à t = 80, 90, 100, 110 et 120 min pour la mesure du plasma [3 – 3 H] glucose activités spécifiques. Recueillir le sang supplémentaires à t = 100 et 120 min pour la mesure de l'insulinémie et de toute autre hormone (s) ou métabolite (s). A t = 110 min, prélever du sang dans un tube héparine ou EDTA-traitée capillaire pour la mesure de l'hématocrite pince. Après l'échantillon à t = 120 min est prise, 2 [14 C] désoxyglucose peut être administrée pour la mesure de tissu-spécifique d'absorption du glucose. Administrer un bolus 12 pCi dans la ligne de bolus connecté à la ligne d'échantillonnage jugulaire (figure 3B </strong>). Obtenir des échantillons de sang (50 pi) de la ligne d'échantillonnage artérielle à t = 2, 15, 25 et 35 min après l'administration du bolus pour la mesure de plasma 2 [14 C] désoxyglucose niveaux. Après le dernier échantillon, anesthésier la souris avec une infusion de pentobarbital donnée directement dans la ligne artérielle. Vite disséquer les tissus nécessaires à l'évaluation de l'absorption du glucose (par exemple, les muscles squelettiques de divers types, les tissus adipeux, cœur, cerveau) et tout les autres tissus (par exemple le foie, rate, reins). Aligner les tissus gèle dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Tissulaire du glucose est analysée en mesurant l'accumulation de 2 phosphorylée [14 C] désoxyglucose dans les tissus congelés et la disparition des deux [14 C] désoxyglucose à partir du plasma. 4. Les résultats représentatifs Un exemple de résultats obtenus à partir d'une expérience pince insuline est montré dans la figure 4.Cet exemple montre la capacité d'un régime riche en graisses résistance à l'insuline précipite chez la souris. Toutes les présentations des résultats pince insuline doit comprendre les éléments suivants pour être interprétable: un cours moment de la glycémie, un cours moment de la GIR et les niveaux d'insuline plasmatique (de base et pince). Comme le montre ici, la glycémie à jeun (figure 4A) et l'insuline (figure 4C) sont plus élevés chez les souris nourris avec un régime riche en graisses, indicatif de résistance à l'insuline. Présenter un cours à temps des niveaux de glucose à travers l'étude de serrage (figure 4A) permet au lecteur d'évaluer dans quelle mesure euglycémie a été maintenu, ce qui est révélateur de la qualité de la pince. De même, un cours moment de la RIF (figure 4B) permet au lecteur de déterminer à quelle vitesse un état ​​stable a été atteint. La présence de ces données comme les cours du temps est nettement plus instructif que la pratique conventionnelle dans la littérature pince de souris insulino de présenter une expérience de 2 heurescomme un point de référence unique représentant des valeurs moyennes à partir d'un indéfini "pince" période (4-13). Dans le présent exemple, les niveaux de glucose ont été égales entre le contrôle et la haute teneur en graisses nourris groupes, mais le RIF était significativement plus faible dans la haute teneur en graisses nourris groupe (figure 4B). Ceci est révélateur d'une déficience dans l'action d'insuline du corps entier. Les niveaux d'insuline Clamp étaient également plus élevés dans la haute teneur en graisses nourris groupe (figure 4C), renforçant la présence d'un phénotype résistance à l'insuline chez ces souris. L'utilisation des perfusions traceur isotopique permet l'évaluation de l'action de l'insuline dans les tissus spécifiques. [3 – 3 H] glucose est utilisée pour estimer la vitesse d'apparition du glucose endogène (Endora), qui est un indice de la production de glucose hépatique (HGP) et le taux de l'ensemble du corps disparition du glucose (Rd). Alors que l'insuline supprime complètement HGP chez les souris témoins, ce sont affaiblies chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (figure 4D). De même, la capacité d'enSulin pour stimuler Rd chez les souris témoins est compromise chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (figure 4E). 2 [14 C] désoxyglucose est utilisée pour évaluer l'indice de métabolisme du glucose (RG), une mesure de tissu-spécifique d'absorption du glucose. Comme vu dans cet exemple, stimulée par l'insuline absorption du glucose dans le muscle squelettique est altérée chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (Figure 4f). Figure 1: Préparation des artères (A) et des cathéters veineux (B) et (C) MASA tm. Cathéters artériels sont préparés par l'insertion d'une pièce de 1,3 cm de PE-10 d'environ 3 mm en une pièce de 6 cm de 0.012 "ID silastic. La pointe PE-10 est biseautée de telle sorte que la longueur du biseau à l'silastic est de 0,9 cm. Veineuse cathéters sont fabriqués en glissant un petit morceau de 0.020 "ID silastic 1,1 cm de l'extrémité biseautée d'une pièce de 6 cm de 0.012" ID silastic. Les 0.020 "ID actes morceau silastic comme une bille de retenue pour soi guérir le cathéter dans la veine jugulaire. Pour l'assemblage du MC MASA, chacune des deux 1,3 cm de calibre 25 connecteurs est inséré dans chacune des deux pièces 3 cm de PE-20. Ce sont maintenues ensemble par un petit morceau de 0.040 "ID silastic. Les connecteurs sont pliés à un angle de 120 ° et séparés à un angle de 45 °. L'ensemble est plongé dans la colle silicone médical. Figure 2: la souris cathétérisés. Les cathéters sont implantés chirurgicalement dans l'artère carotide gauche et la veine jugulaire droite. Les extrémités libres des cathéters sont externalisés derrière la tête et relié à un tm MASA. Le MC est inséré sous la peau MASA entre les omoplates. Cela permet un accès vasculaire au cours d'expériences pince insuline sans la nécessité de limiter, manipuler ou anesthésier la souris. jpg "/> Figure 3: Représentation de la ligne de temps d'installation et d'une expérience pince insuline. La souris est attaché à un émerillon double canal qui agit comme un hub pour perfusion et des seringues de prélèvement. Configurations typiques pour des expériences de ne pas utiliser des infusions traceur (A) et en utilisant à la fois [3 – 3 H] glucose et 2 [14 C] désoxyglucose (B) sont présentés. Une ligne du temps des procédures de mise en place et l'exécution de la pince d'insuline (C) est également représentée. Pendant le clamp, des échantillons de sang ( ) Sont prises toutes les 10 min pour mesurer la glycémie. Le RIF est ajusté en conséquence pour maintenir l'euglycémie. Les échantillons destinés à base de glucose sanguin, l'insuline plasmatique, et le plasma [3 – 3 H] glucose sont prises à t = -15 et -5 min. Les échantillons de plasma pour la pince [3 – 3 H] glucose sont prises à t = 80, 90, 100, 110 et 120 et pour l'insuline pince à t = 100 et 120 min. 2 [14 C] désoxyglucose est administré après que l'échantillon à t = 120 min et blood sont collectées à t = 2, 15, 25 et 35 min après. Les tissus sont prises après que l'échantillon t = 35 min. Figure 4: Résultats d'une expérience comparant l'insuline pince souris sur un régime de contrôle (Chow) à des souris à un régime riche en graisses (SIH). Bien sûr le temps de glucose artérielle (A) et l'insuline RIF (B), de base et pince (C), Endora (D), et Rd (E) et le muscle squelettique (gastrocnémien et vaste externe) RG (F) sont affichés. Tous les résultats indiquent l'effet de l'alimentation riche en graisses pour induire une insulinorésistance.