Hyperinsulinemische-euglycemic Klemmen in Bewust, ongeremde Muizen

1. Voorbereiding van katheters en muis Antenne voor bemonstering Toegang (MASA tm) Bereid arteriële katheter door het invoegen van een 1,3 cm stuk van PE-10 (0,011 inch inwendige diameter) in een 6 cm stuk silastic buis (0,012 inch inwendige diameter) zoals weergegeven in figuur 1A. Bevel het topje van de PE-10 met een scalpel, zodat de lengte van het einde van de silastic tot aan de punt van de schuine kant is 0,9 cm. Bereid veneuze katheter door met een 1 mm stuk silastic buis (0,020 inch binnendiameter) 1,1 cm vanaf het schuine uiteinde van een 6 cm stuk silastic buis (0,012 inch inwendige diameter) zoals weergegeven in figuur 1B. De 1 mm stuk van silastic wordt gebruikt als een remmende kraal. Ter voorbereiding op een MASA tm, plaatst elk van de twee 1,3 cm stukken van 25 meter roestvrij stalen connectors in elk van de twee 3 cm stukken van PE-20 (0,015 inch binnendiameter). Bevestig de PE-20/connectors aan elkaar door te schuiven van een 5 mm stuk silasticslang (0,040 inch binnendiameter) over het gebied waar de stalen buizen en PE-20 te voldoen. Buig de stalen buizen met een ~ 120 °-hoek en een aparte elke buis door de ~ 45 °. Plaats afgerond rig in een klodder van medische silicone lijm zodanig dat de PE-20 buizen verticaal is en de uiteinden van de roestvrij stalen buizen verder reiken dan de lijm (Figuur 1C). Toestaan ​​dat deze in te stellen voor 24 uur. 2. Chirurgische catheterisatie Voorafgaand aan de ingreep, katheters met 70% ethanol steriliseren, vul ze met gehepariniseerde zoutoplossing (200 U heparine / ml zoutoplossing) en steek roestvrij staal pluggen. Verdoven muis, bij voorkeur volgens een methode die continu levert de anestheticum (bijv. geïnhaleerd isofluraan). Met behulp van steriele techniek, verwijder haar van de incisie sites die gebruik maken clippers en / of een ontharingscrème en desinfecteren van de huid met alcohol, gevolgd door een betadine scrub. Voor de catheter inbrengen, verwijderen haar op degebied dat zich uitstrekt van de onderkaak naar de top van de ribbenkast en tussen de sleutelbeenderen. Voor uitbesteding van de katheters achter de kop, verwijder haren in het gebied tussen de basis van de schedel en de interscapular regio en desinfecteren van de huid met alcohol, gevolgd door een betadine scrub. Leg de muis op zijn rug op een warming oppervlak en onder het weergavegebied van een chirurgische microscoop. Zet de staart en ledematen met chirurgische tape. Zet de kop in de neuskegel het leveren van de anesthesie. Maak een kleine verticale incisie middellijn 5 mm Cephalic aan het borstbeen. Met behulp van een tang, stompe ontleden het weefsel aan de linkerkant musculus sternocleidomastoideus spier bloot te leggen. Weerspiegelen deze spier aan de linkerkant halsslagader bloot te leggen. Voorzichtig te plagen af ​​bindweefsel van de slagader. Het is belangrijk op dit punt naar de nervus vagus van de slagader te isoleren zonder beschadiging van zowel de arterie of de zenuw. Isoleer de slagader en ligeren van de cephalic einde met zijden hechtdraad. Losjes knoop een anderstuk van hechting aan de caudale einde van de blootgestelde schip. Klem schip met een micro-serrefine klem op de caudale einde en juist onder de geligeerde eindigen met veer schaar. Steek voorzichtig katheter tot aan de klem. Voorzichtig los van de micro-serrefine klem en vooraf de katheter naar de silastic-PE kruising. Bind beide ligaturen aan de katheter en bevestigen dat de katheter monsters door het aansluiten van het vrije uiteinde van de katheter om een ​​steekproef spuit. Maak nog een incisie 5 mm aan de rechterkant van middellijn en ongeveer 2 mm caudaal van de eerste incisie. Met behulp van een tang, stompe ontleden het weefsel bloot te leggen en te isoleren van de rechter halsader. Zorgvuldig afbinden van de Cephalic einde met zijden hechtdraad en losjes een ander stuk van de hechting band rond het caudale einde. Juist onder de cefalische ligatuur met lente schaar en steek de katheter tot aan de remmende kraal. Bind een hechting achter de hiel en bevestigen dat de katheter monsters. Turn met de muis over en maken een kleine incisie tussen de schouderbladen. Tunnel een 14-gauge naald onder de huid van de incisie voor de arteriële katheter, op de voorkant van de muis, om de interscapular incisie op de rug. Rijg de arteriële katheter door de naald te exterioriseren aan de achterkant van de muis. Herhaal dit voor de halsader katheter door de ondertunneling van de 14-gauge naald onder de huid aan de rechterkant van de muis van de incisie aan de voorzijde om de interscapular incisie op de rug. Klem de arteriële katheter met een micro-serrefine klem op de incisie plaats tussen de schouderbladen. Snijd de catheter ~ 1 cm boven deze klem. Plaats de MASA tm met de roestvrij stalen connectors tegenover de richting van het hoofd van de muis. Sluit de arteriële katheter om de rvs-connector wees in de richting van de linkerkant van de muis. Let erop dat er geen gaten of knikken in de katheter. Herhaal dit voor de veneuze katheter,aan te sluiten op de RVS connector naar de rechterkant van de muis. Plaats de MASA tm in de incisie tussen de schouderbladen. De PE-20 buizen die overeenkomt met de halsader katheter moet worden aan de rechterkant van de muis en de PE-20 buizen die overeenkomt met de arteriële katheter moet worden aan de linkerkant. Sluit ventrale en dorsale incisies met nylon hechtdraad. Voor de dorsale sluiten, kan de hechting worden uitgevoerd door de geharde siliconen van de MASA tm om het vast te zetten. Bevestigen doorgankelijkheid van de katheter met behulp van een spoeling oplossing die gehepariniseerde zoutoplossing en een antibiotica om het risico van besmetting te minimaliseren. Plaats de muis in een warme, schone kooi voor onmiddellijk herstel. Figuur 2 toont het eindproduct. Laat de muis om te herstellen voor ten minste 5 dagen. Monitor gewicht en de algehele gezondheid. Gebruik maken van de juiste post-operatieve pijnstiller regime, zoals goedgekeurd door Animal van de instelling Zorg enGebruik comite. 3. Hyperinsulinemische-euglycemic clamp Snel met de muis voor 5-6h. Als referentie, de tijd t = 0 min verwijst naar het einde van het vasten en het begin van de insuline en glucose-infuus (dat wil zeggen de klem periode). De setup en de tijd lijn voor een typisch experiment zijn weergegeven in figuur 3. Gebruik Micro-Renathane of een gelijkwaardige buis voor infusie en bemonstering lijnen. Schorsing van een dual-channel draaien boven de muis. Dit dient als een hub tussen de muis en infusie / sampling spuiten. Tijdens het experiment, de muis blijft in een kooi of een soortgelijke container en is gebonden aan het draaien. Voorafgaand aan het aansluiten van de muis, vul de arteriële sampling lijn met gehepariniseerde zoutoplossing (10 U heparine / ml zoutoplossing) en plaats een RVS connector aan de onderkant van de lijn. Laat een spuit met gehepariniseerde zoutoplossing (clearing spuit) aangesloten op de top van de bemonstering lijn. Deze zal worden gebruikt voor het opstellen van bloed samples. Vul de veneuze infusie lijn met niet-gehepariniseerde zoutoplossing vanaf de infusie poort van de koppeling (segment A in figuur 3A) helemaal naar de onderkant van de lijn. Steek de bovenkant van de lijn en plaats een roestvrij staal connector (of een Y-connector als een bolus moet worden toegediend) aan de onderkant van de lijn. Als een isotopische glucose tracer (bijv. [3 – 3 H] glucose) wordt toegediend, zorgen voor een 1 ml spuit met de tracer aan een infuus spuit. Vul de veneuze infusie lijn met tracer in plaats van een zoutoplossing (Figuur 3B). Drie uur in de snelle, wegen de muis en sluit de PE-20 voor de halsader en arteriële katheters aan de infusie en bemonsteringsleidingen, respectievelijk. Als het toedienen [3 – 3 H] glucose tracer, begint een gegrond-tracer continu infuus op t = -90 min (Figuur 3C). Een typisch priming dosis is 1 uCi. Maak een 0,05 uCi / ul [3 – 3 H] glucose solution in niet-gehepariniseerde zoutoplossing. Laad de oplossing in een 1 ml spuit en zet de spuit in een infusiepomp. Dien de priming dosis door het inbrengen van 20 pl / min voor 1 min. Volg met een continue infusie van 0,05 uCi / min (een ul / min) voor een 90 min. evenwicht periode. Bereid infusates van insuline en glucose. Insuline is bereid in niet-gehepariniseerde zoutoplossing met 3% plasma als drager (een passende concentratie van de BSA kan ook gebruikt worden). Glucose infusates zijn commercieel verkrijgbaar in verschillende concentraties (5, 20 en 50%). Bereid zout-gewassen erythorocyte infusaat door het verkrijgen van volbloed van een donor muis, bij voorkeur van dezelfde stam achtergrond als de experimentele muis. Typisch 1 ml bloed nodig is per studie muis. Centrifuge bloed te scheiden erytrocyten. Was erytrocyten met 10 U / ml heparine zoutoplossing en gecentrifugeerd om de zoutoplossing te verwijderen. Bepaal het volume van de erytrocyten en resuspendeer in een gelijk volume van 10 U / ml hepariherkend zoutoplossing. Trek elke infusaat in een 1 ml spuit en veilige elke spuit een individuele infusiepomp. Sluit elke spuit aan op een 4-weg connector (Figuur 3). Op t = -15 min neem een ​​bloedmonster door langzaam het opstellen van 50 tot 100 ul van bloed in de open plek spuit. Klem de arteriële bemonsteringslijn en verwijder de open plek spuit. Met behulp van een hand-held glucose meter, neem dan een bloedglucose lezing door het verwijderen van de klem op de arteriële bemonsteringslijn en waardoor het bloed te stromen in de glucose-meter strook. Zodra de glucose wordt gemeten, klem de arteriële bemonsteringslijn en steek een stompe naald spuit (bemonstering spuit) in de arteriële bemonsteringsleiding. Verwijder de klem en trek een volume van bloed (zie Toelichting) in de steekproef spuit. Klem de arteriële bemonsteringslijn en verwijder de bemonstering spuit. Steek de open plek spuit in de arteriële bemonsteringsleiding. Het opstellen van op de zuiger om eventuele luchtbellen te verwijderen en opnieuw te bezielen de50 tot 100 ul van bloed dat oorspronkelijk is gesteld. Opmerking: Het volume van de bemonsterde bloed hangt af van de analyse wordt uitgevoerd. Bijvoorbeeld, de analyse van [3 – 3 H] glucoseconcentratie 10 ul van plasma vereist, zodat 50 ul van bloed worden getrokken. Dit levert 20 tot 30 ul van plasma, hetgeen voldoende is voor de analyse plus extra plasma indien nodig. Metingen van hormonen en andere metabolieten (bijv. insuline, vrije vetzuren) nodig bemonstering van extra bloed. Doseer het bloed in de steekproef spuit in een EDTA-gecoate microbuisjes. Centrifuge en het verzamelen van het plasma. Houd het plasma op ijs tot aan het einde van de studie of onmiddellijk bewaren bij -20 ° C. Herhaal stap 3,10 tot 3,12 op t = -5 min. Verkrijgen van extra bloed (50 ul) in voor meting van de baseline plasma insuline niveaus. Meet baseline hematocriet door het opstellen bloed in een heparine-of EDTA behandelde capillair. De metingen die frOM plasmamonsters op t = -15 en -5 min vertegenwoordigen baseline (dwz vasten) waarden. Nadat het monster op t = -5 min, vul het infuus lijnen voor glucose, insuline en zout-gewassen erytrocyten tot en met de 4-weg connector. Sluit de 4-weg connector aan de slang verbonden met de draaibare infusie-poort (of de slang aangesloten op de Y-connector als infusie [3 – 3 H] glucose) zoals weergegeven in figuur 3. Begin inbrengen van de zoutoplossing gewassen erytrocyten eerst. Stel de infusiesnelheid tot het totale volume van het bloed worden bemonsterd over de duur van de studie (bijvoorbeeld als een totaal van 500 ui van het bloed worden bemonsterd meer dan 120 min van het onderzoek, stelt u de infusiesnelheid tot 4,2 pl / min) te vervangen. In tegenstelling tot de andere infusates, de erytrocyten oplossing is rood. Inbrengen van deze oplossing eerst zorgt voor eventuele weerstand of obstructies in het infuus lijnen worden geïdentificeerd en gecorrigeerd. Zodra de rode bloedcel infusaat bereikt met de muis, begin van de insuline englucose infusies. Dit is nu t = 0 min. Insuline wordt toegediend met een constante, vooraf bepaald tarief. Een insuline-infusie van 4 mU • kg -1 • min -1 zal de endogene productie van glucose meestal te onderdrukken door 80-100% en het stimuleren van glucose verdwijning van 2-3 maal. De initiële glucose infusiesnelheid (GIR) is geschat op basis van de baseline bloedsuikerspiegel en eerdere ervaringen. Als inbrengen [3 – 3 H] glucose, kan men ervoor kiezen om de tracer infusiesnelheid te verhogen om de geschatte toename van de glucose-omzet (meestal een 2-3 voudige toename) wedstrijd. Gezien de hoge mate van glucose omzet in de muis, moet bloedmonsters worden verkregen van de arteriële lijn niet minder dan elke 10 minuten voor het meten van glucose concentratie over de duur van het experiment. Stel de GIR het bereiken en handhaven doel euglycemia (Figuur 3C). Dit doel kan variëren, afhankelijk van het model of de doelstellingen van de studie. Een goede doel glucose concentratie is 150 mg • dl-1, omdat dit een typisch 6u nuchtere glucose niveau voor een chow-fed C57BL/6J muis. Het doel is om snel te bereiken euglycemia, bij voorkeur binnen de eerste 40 tot 50 min, en glucose en GIR stabiel hebben aan het begin van de steady-state periode (t = 80 min). Als inbrengen [3 – 3 H] glucose, extra bloed te verkrijgen bij t = 80, 90, 100, 110 en 120 min voor het meten van plasma [3 – 3 H] glucose specifieke activiteit. Verzamel extra bloed op t = 100 en 120 min voor het meten van plasma insuline en een ander hormoon (s) of metaboliet (s). Op t = 110 min, trekken bloed in een heparine-of EDTA behandelde capillaire buis voor het meten van klem hematocriet. Nadat het monster op t = 120 min wordt genomen, 2 [14 C] deoxyglucose kan worden toegediend voor het meten van weefsel-specifieke opname van glucose. Dien een 12 pCi bolus in de bolus lijn aangesloten op de vette bemonstering lijn (Figuur 3B </strong>). Verkrijgen van bloedmonsters (50 ul) van de arteriële bemonsteringslijn op t = 2, 15, 25 en 35 minuten na toediening van de bolus voor de meting van plasma 2 [14 C] deoxyglucose niveaus. Na de laatste monster, verdoven van de muis met een infusie van pentobarbital rechtstreeks in de arteriële lijn. Snel ontleden elke weefsels die nodig zijn voor de beoordeling van de glucose-opname (bijv. skeletspieren van verschillende types, vetweefsel, hart, hersenen) en eventuele andere weefsels (bv lever, milt, nieren). Snap bevriezen weefsels in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot geanalyseerd. Tissue glucose wordt geanalyseerd door het meten van de accumulatie van gefosforyleerde 2 [14 C] deoxyglucose in de bevroren weefsels en het verdwijnen van 2 [14 C] deoxyglucose uit het plasma. 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van de resultaten verkregen uit een insuline klem experiment is weergegeven in Figuur 4.Dit voorbeeld toont het vermogen van een hoog vet dieet voor het neerslaan van insuline resistentie bij muizen. Alle presentaties van de insuline klem resultaten moet de volgende te interpreteren: een tijdsverloop van de bloedsuikerspiegel, een tijdsverloop van de GIR-en plasma-insuline-niveaus (baseline en klem). Zoals hier getoond, nuchtere glucose (Figuur 4A) en insuline (figuur 4C) hoger zijn bij muizen gevoed een hoog vet dieet, indicatief van de insulineresistentie. Presenteren een tijdsverloop van de glucosespiegels in de klem studie (Figuur 4A) kan de lezer om te beoordelen hoe goed euglycemia werd gehandhaafd, wat indicatief is voor de kwaliteit van de klem. Ook een tijdsverloop van de GIR (Figuur 4B) kan de lezer om te bepalen hoe snel een steady-state werd bereikt. Tonen deze gegevens als de tijd opleidingen is aanzienlijk meer informatief dan de conventionele praktijk in de muis insuline klem literatuur van de presentatie van een 2-uur experimentals een gegeven punt dat de gemiddelde waarden van een undefined "clamp" periode (4-13). In het onderhavige voorbeeld, glucose-niveaus waren gelijk tussen de controle en vetrijke gevoede groepen, maar het GIR was significant lager in de hoog vet gevoede groep (Figuur 4B). Dit wijst op een stoornis in het gehele lichaam de werking van insuline. Klem insuline niveaus werden ook hoger in de hoog vet-gevoede groep (figuur 4C), verder ondersteunen van de aanwezigheid van een insuline-resistente fenotype bij deze muizen. Het gebruik van isotopen tracer infusies maakt voor de beoordeling van de werking van insuline in specifieke weefsels. [3 – 3 H] glucose wordt gebruikt om de snelheid van endogene glucose verschijning (endoRa), dat is een index van de glucoseproductie door de lever (HGP) en de snelheid van het hele lichaam glucose verdwijning (Rd) te schatten. Overwegende dat de insuline volledig onderdrukt HGP in controle muizen, wordt dit verminderd bij muizen gevoed een hoog vet dieet (Figuur 4D). Ook het vermogen van insulin aan Rd te stimuleren in controle muizen in het gedrang bij muizen gevoed een hoog vet dieet (figuur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose wordt gebruikt om de glucose stofwisseling index (RG), een maat van weefsel-specifieke opname van glucose te beoordelen. Zoals in dit voorbeeld, is insuline-gestimuleerde glucose-opname in de skeletspieren aangetast bij muizen gevoed een hoog vet dieet (Figuur 4F). Figuur 1: Bereiding van arteriële (A) en (B) veneuze katheters en (C) MASA tm. Arteriële katheters worden voorbereid door het invoegen van een 1,3 cm stuk van PE-10 ongeveer 3 mm in een 6 cm stuk van 0,012 "ID silastic. De PE-10 tip is schuine zodanig dat de lengte van de schuine kant naar de silastic is 0,9 cm. Veneuze katheters zijn gemaakt door schuiven een klein stukje van de 0.020 "ID silastic 1,1 cm vanaf het schuine uiteinde van een 6 cm stuk van 0,012" ID silastic. De 0.020 "ID silastic stuk fungeert als een straatverbod kraal aan bij genezen van de katheter naar de halsader. Voor de montage van de MASA tm, elk van twee 1,3 cm 25-gauge-connectors wordt in elk van de twee 3 cm stukken van PE-20. Deze worden bij elkaar gehouden door een klein stukje van de 0.040 "ID silastic. De aansluitingen zijn gebogen om een ​​120 °-hoek en gescheiden in een hoek van 45 °. Het geheel is ondergedompeld in de medische silicone lijm. Figuur 2: gecatheteriseerd muis. Katheters zijn chirurgisch geïmplanteerd in de linker halsslagader en de rechter halsader. De vrije uiteinden van de catheters worden geëxternaliseerd achter het hoofd en aangesloten op een MASA tm. De MASA tm wordt subcutaan ingevoegd tussen de schouderbladen. Dit zorgt voor vasculaire toegang tijdens de insuline-clamp experimenten zonder de noodzaak te beteugelen, verwerken of verdoven van de muis. jpg "/> Figuur 3: Schets van de setup en de tijd lijn voor een insuline-clamp experiment. De muis is gebonden aan een dual-channel draaien, dat fungeert als een hub voor infusie en bemonstering spuiten. Typische instellingen voor experimenten niet gebruiken van tracer infusies (A) en met behulp van zowel [3 – 3 H] glucose en 2 [14 C] deoxyglucose (B) worden getoond. Een tijd lijn van de procedures voor het opzetten en uitvoeren van de insuline-klem (C) wordt ook weergegeven. Tijdens de klem, bloedmonsters ( ) Worden elke 10 min. tot de bloedglucose te meten. De GIR is aangepast aan euglycemia te behouden. Monsters voor baseline bloedglucose, plasma insuline, en plasma [3 – 3 H] glucose worden genomen op t = -15 en -5 min. Monsters voor klem plasma [3 – 3 H] glucose worden genomen op t = 80, 90, 100, 110 en 120 en voor klem insuline op t = 100 en 120 minuten. 2 [14 C] deoxyglucose wordt toegediend nadat het monster op t = 120 min en blood is verzameld op t = 2, 15, 25 en 35 minuten na. Weefsels worden genomen nadat de t = 35 min monster. Figuur 4: Resultaten van een insuline-clamp experiment vergelijken van muizen op een dieet (Chow) om muizen op een hoog vet dieet (HFD). Tijdsverloop van arteriële glucose (A) en GIR (B), baseline en klem insuline (C), EndoRa (D), en Rd (E) en de skeletspieren (gastrocnemius en vastus lateralis) Rg (F) worden getoond. Alle resultaten wijzen op het effect van vetrijke voeding voor insulineresistentie induceren.