Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.
, Tip 2 diyabet ve Langerhans arıza 1 adacık patogenezinde soruşturmalar organ bağışına 2 tip 2 diyabetik adacıklar sınırlı sayıda engel var . Burada adacıklar tip 2 diyabetik ve non-diyabetik hastalarda farklı pankreas hastalıkları (iyi veya kötü huylu pankreas tümörleri, kronik pankreatit ve koledok veya duodenal tümörlerin) nedeniyle kısmi pankreatektomi geçirmiş elde İnsan pankreas dokusundan izole etmek için protokol paylaşmak . Katılan tüm hastalara aynı zamanda yerel etik komitesi tarafından onaylanmış olan bu çalışma, onların rızasını verdi. Cerrahi örneklerin hemen tanısal amaçlı hasarlı doku istinat yumuşak ve sağlıklı görünmesini pankreatik doku, adacık izolasyonu için seçilen patolog teslim edildi. 1.000 'den fazla adacıkları izole için, pankreas dokusunun en az 2 g ile başlamak zorundaydık. Ayrıca bizim protokol gerekli enzim içeren medya enjekte gözle görülür bir doku gerilmek ve daha sonra yüzey alanını artırarak sindirime yardımcı olmak için kıyma oldu.
İnsan pankreas dokusu büyük miktarda (> 15g) kullanılabilir olduğu zaman zaman durum dahil etmek için protokol uygulanabilirliği genişletmek için, doku sindirmek için bir Ricordi odası (50 ml). Sindirim sırasında, elle numune ile doku fibrozis seviyesine göre değişen bir yoğunlukta Ricordi kamara 3 salladı. Bir süreksiz Ficoll degrade sonra asiner doku adacıkları ayırmak için kullanılır oldu. Biz doku pelet kadar küçük homojen Ficoll ortamda 1.125 g / ml 'lik bir yoğunluk ile yeniden süspanse olması gerektiğini kaydetti. Izolasyondan sonra, biz onların fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırmak için en az 48 saat süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° stressiz koşulları (hiçbir sallayarak veya rotasyon) ° C altında adacıklar kültür. Protokol ve gelecekteki gelişme yaygın uygulama, tip 2 diyabet araştırma büyük ölçüde ilerleyen, diyabetik insan adacık büyük miktarlarda zamanında hasat ve non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu sağlayabilir.
Bizim protokolünü kullanarak, insan adacıklar kısmi pankreatektomi alınan pankreas dokusundan izole edilebilir. Bu protokolün başarı birkaç kritik noktaları sırasında alınan bakım dayanır. Beta-hücre canlılığını korumak için, numune laboratuvara buz üzerinde hızla taşınması olması esastır. Ayrıca, doku sindirim süresi, doku fibrozis ve medya enzimatik aktivite derecesine göre ampirik olarak optimize edilmiş olmalıdır. Bu Ricordi odasına elle uygulanan mekanik kuvvet derecesi için de geçerlidir. Böylece iyi bir adacık verimi elde etmek için, protokol en iyi özel bir bilim adamı ya da teknik yardımcısı tarafından yapılır. Takım zaten adacık izolasyonu yaşanan sürece İlk başarısızlık norm.
Adacık izolasyon protokolü ve standart insan adacık izolasyon yöntemi arasında önemli farklılıklar vardır: 1) cerrahi işlem sırasında birkaç saat iskemi maruz pankreas dokusu kullanmasına rağmen, hemen sitesinde işlenir. Bu tahsisi ve adacık izolasyonu tesisi teslim sırasında birkaç saat için iskemik kalan pankreas / adacık nakli için beyin-ölü donörler, eksplante pancreata aksine. Standart bir protokol pankreatik kanal içine demlenmeye 2) ise, doğrudan pankreas dokusu içine enjekte kollajenaz. 3) Biz COBE hücre işlemci kullanarak sürekli bir Ficoll degrade adacıklar toplama yerine süreksiz Ficoll degrade kullanarak adacıklar ayırın.
Cerrahi numune çok fibrotik veya yeterli sayıda adacık izole etmek için kıt olduğu durumlarda, doku hala lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) 10 tarafından alınacak. Bu gen ekspresyonu verileri adacık izolasyon başarısız ya da verim çok düşük olsa bile, hemen hemen her numune tahsil edilecek sağlar. Ne yazık ki, LCM fonksiyonel çalışmalar için canlı hücreler üretmek değildir ve bunların tutarı proteomik analiz için genellikle yetersiz kalmaktadır. Böylece, adacıklar almak için kollajenaz sindirim protokolü ile paralel olarak LCM kullanarak cerrahi örnekleri işlemek için en etkili yolu olabilir.
Kısmi pancreatectomies adacık izolasyonu için doku toplarken, hastanın klinik öykü ve metabolik durumunu dikkatle incelemek için önemlidir. Kısmen pancreatectomized bir hasta tip 3c diyabet yani şeker hastalığı, cerrahi 6 yol açan pankreas bozukluğu ikincil tarafından etkilenmiş olabilir . Kliniğimizde 2010 yılında bu ameliyat geçiren 43 katılan hastalar arasında, 32 non-diyabetik, 5 tip 2 diyabet ve 6 etkilendi tipi 3c diyabet vardı. Bu veriler, daha önceki çalışmaları ile bozulmuş glikoz metabolizması ve diyabet pankreas kanser veya kronik pankreatit 6 muzdarip hastaların büyük bir kısmını işaret kabul etmiş sayılırsınız. Biz birincil kökenli 7 pankreas ameliyatı olan semptomların başlangıcından önce en az bir yıl tanısı kondu diyabet olarak kabul edilecek. Adacık otoantijenler karşı antikor düzeyleri de potansiyel bir diyabet 8 otoimmün kökenli değerlendirmek için ölçülmelidir. Pankreatektomi geçiren bir hastanın, tanı konmamış diyabet muzdarip veya glukoz hoşgörüsüz olabileceğinden, tüm non-diyabetik hastalarda oral glukoz tolerans testi önce 9 pankreatektomi verilmelidir .
The authors have nothing to disclose.
Biz projenin çeşitli aşamalarında yardım, tavsiye ve kritik giriş birçok meslektaşları teşekkür etmek istiyorum. Bu video makalenin Üretim, Eğitim ve Araştırma (BMBF), Diyabet Araştırma (DZD, Alman Merkezi Alman Bakanlığı fon http://www.dzd-ev.de), IMIDIA (http://www imidia.org ) ve Teknoloji Dresden Üniversitesi, Üniversite Hastanesi Carl Gustav Carus. Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n ° 115.005 altında Yenilikçi Tıp Girişimi, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı.
Name | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Equipment | ||
1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
Surgical forceps | Braun | BD168R |
Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
Reagents | ||
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
Enzyme Solution
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
Euro Collins Solution
Ficoll Stock Solution
Ficoll Gradients